聂 群,董 晶,聂李平,周 宇,谢闻悦,李建新*

(1.深圳市大鹏新区妇幼保健院 检验科，广东 深圳518120；2.北京大学深圳医院 检验科，广东 深圳518036)

标本溶血对常规凝血试验和纤溶标志物测定结果的影响

聂 群1,董 晶2,聂李平2,周 宇2,谢闻悦2,李建新2*

(1.深圳市大鹏新区妇幼保健院 检验科，广东 深圳518120；2.北京大学深圳医院 检验科，广东 深圳518036)

目的探讨标本溶血对常规凝血试验(包括PT、APTT和Fbg)和纤溶标志物(包括D-dimer和FDP)测定结果的影响。方法对48例溶血标本和2 h内(平均65 min)重新采集的未溶血配对标本分别进行常规凝血试验和纤溶标志物测定；另对30例未溶血标本体外机械诱导溶血，分别于溶血前后进行常规凝血试验和纤溶标志物测定。结果对于临床溶血和未溶血配对标本，PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP在两者间均无显著性差异；对于诱导溶血标本，诱导溶血前后PT、APTT、Fbg和FDP均无显著性差异；诱导溶血后较溶血前D-dimer降低(361.10±493.40 VS 396.37±494.47 μg/L，P< 0.001)。以上参数结果在溶血和未溶血标本之间，Pearson相关分析均呈高度相关(r均>0.97，P均<0.001)，Bland-Altman图均显示一致性良好。以上参数改变值和溶血程度均不相关(P均>0.05)。结论标本溶血对常规凝血试验和FDP的测定结果无明显影响，体外机械诱导溶血对D-dimer测定结果造成较小的负性影响，但不影响临床决定。应对拒收溶血标本用于常规凝血测试的规定进行再评估。

溶血；常规凝血试验；D-dimer；FDP

(ChinJLabDiagn,2017,21:2115)

常规凝血试验[包括凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)和纤维蛋白原(fibrinogen,Fbg)]是临床血凝实验室执行得最多的测试，广泛用于筛选检测遗传性和获得性凝血缺陷、抗凝和溶栓治疗监测、术前患者止凝血功能评估、弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)的筛选诊断、凝血抑制物筛选、静脉血栓筛查等[1，2]。纤溶标志物D-二聚体(D-dimer)和纤维蛋白(原)降解产物(fibrin/fibrinogen degradation products,FDP)也是临床频繁地申请的止血检测项目，在辅助排除诊断静脉血栓形成(venous thromboembolism,VTE)、判断VTE再发风险、评估抗凝治疗持续时间、DIC的诊断和管理方面具有非常重要的意义[3，4]。FDP和D-dimer联合检测还可以鉴别诊断原发性纤溶和继发性纤溶[5]。

凝血试验易被一些分析前技术变量影响，如采血装置、标本收集管、标本运送和储存条件等等[6，7]。在送达临床实验室的凝血试验标本中，溶血是较常见现象[7]。溶血可能导致凝血因子活化和干扰测量终点判读，因此，美国临床实验室标准化研究院(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)H21-A4指南规定，对于常规凝血试验如PT和APTT，应拒收肉眼可见的溶血标本[6]。Laga AC等[7]报道，标本溶血虽然影响PT和APTT测试结果，但影响程度较轻，似乎对临床决定无重要意义。但Lippi等[8]根据他们以冻融法诱导溶血的实验结果认为，仅轻微溶血标本可供凝血测试，中度以上的溶血标本会影响常规凝血试验结果的可信度。基于这些，在CLSI新的H21-A5指南[9]中，无明确规定应拒收溶血标本用于常规凝血试验。

关于标本溶血对纤溶分子标志物D-dimer和FDP测定的影响，相关报道较少。本文从两个方面前瞻性研究标本溶血对常规凝血试验和纤溶标志物测定结果的影响：首先研究临床送检的溶血的凝血测试标本和2小时内重新采集的非溶血配对标本的常规凝血试验和纤溶标志物测定结果差异，再研究标本在机械诱导溶血前后的常规凝血试验和纤溶标志物测定结果差异。

1 材料与方法

1.1 临床溶血标本

患者静脉血采集于2 ml 109 mmol/L枸橼酸钠抗凝真空管(广州阳普公司)，血液与抗凝剂的比例为9∶1。溶血定义为标本经2 500×g离心15 min后，血浆以裸眼观察呈粉红色到红色。接收到溶血标本后，立即通知临床重新采集非溶血标本送检。时间间隔在2 h内的溶血和非溶血配对标本才纳入本研究。常规凝血试验在标本接收后2 h内以Sysmex CA 1500和Stago Compact血凝仪完成测试，每对溶血和非溶血配对标本只在一台血凝仪上测试。Sysmex CA 1500血凝仪常规凝血试验所用试剂由德国Siemens公司提供，PT试剂为Thromborel-S，APTT试剂为Actin和0.025 mol/L氯化钙，Fbg试剂为Thrombin Reagent (100NIH)。Stago Compact血凝仪采用其配套试剂，PT试剂为STA○RNeoplastine○RCI Plus 10，APTT试剂为STA○RPTT Automate 5，Fbg试剂为STA Fibrinogen 5。D-dimer和FDP测定也在标本接收后2 h内完成，所用仪器为Sysmex CA 1500。D-dimer测定采用Siemens公司的D-dimer Assay PLUS试剂，该试剂采用D-dimer单克隆抗体，特异性强，不受纤维蛋白原和其他纤维蛋白降解产物的影响；采用乳胶增强型免疫比浊法进行检测，最低检测限值为50 μg/L，检测线性范围为50-9999 μg/L，CV < 5%。FDP测定也采用乳胶增强型免疫比浊法试剂，生产厂家为日本第一化学株式会社。

1.2 体外机械诱导溶血标本

随机收集未溶血凝血测试标本30例，先作常规凝血试验、D-dimer和FDP测试，再盖上盖子，在混旋器上强力混旋30 min，人为机械剧烈震荡诱导标本溶血，2 500 × g离心15min后再作常规凝血试验、D-dimer和FDP测试。所有测试在3 h内完成。

1.3 血浆游离血红蛋白(free hemoglobin,fHgb)测定

采用邻-甲联苯胺法，按操作规程[10]测定。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 临床溶血标本

一共48对溶血和非溶血配对标本纳入研究。34对标本来自ICU，4对来自CCU，其它来自产科、神经内科、内分泌科、神经外科、消化内科等。溶血和非溶血配对标本的采集时间间隔平均为65 min。32对标本的常规凝血试验在Stago Compact血凝仪上完成，另外16对标本在Sysmex CA 1500血凝仪上完成。溶血标本的血浆fHgb为2.01±1.37 g/L，覆盖了临床常见标本溶血的血浆fHgb范围。

溶血和未溶血配对标本的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP结果均无显著性差异(P均>0.05，表1)，且均呈高度相关(r均>0.97，P均<0.001)。Bland-Altman图显示，溶血和未溶血配对标本的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP结果差值均较小，大于95%的差值位于一致性界限内，也即溶血和未溶血配对标本的结果一致性良好。PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP改变值与fHgb不相关，r分别为-0.176、-0.032、0.131、0.030和-0.160，P分别为0.232、0.829、0.375、0.840和0.277。

表1 溶血和重采未溶血配对标本的常规凝血试验和纤溶标志物结果

2.2 体外机械诱导溶血标本

14对标本的常规凝血试验在Stago Compact血凝仪上完成，另外16对标本在Sysmex CA 1500血凝仪上完成。诱导溶血标本的血浆fHgb为1.71±1.29 g/L。

诱导溶血前后的PT、APTT、Fbg和FDP结果均无显著性差异(P均>0.05)，但诱导溶血后较溶血前D-dimer降低(P< 0.001)(表2)，溶血前后的结果均呈高度相关(r均>0.98，P均<0.001)。Bland-Altman图显示，诱导溶血前后的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP结果差值均较小，大于95%的差值位于一致性界限内，也即诱导溶血前后的结果一致。PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP的结果差值与fHgb不相关，r分别为0.068、-0.084、0.108、0.010和-0.160，P 分别为0.722、0.657、0.5705、0.398和0.958。

表2 体外机械诱导溶血前后的的常规凝血试验和纤溶标志物结果

3 讨论

标本溶血往往是因为采集、运输过程中方法不当引起的。针头过细、抽入气泡、止血带扎的时间过长以及运输过程中的不当等原因都可造成标本溶血。标本溶血是较常见现象，约占送达临床实验室标本的3%左右[7,11]，约占标本不合格原因的40%-70%[11]。标本体外溶血通过一系列机制影响临床化学测试结果[11]。标本溶血导致带负电荷的红细胞膜磷脂暴露，可能会加速凝血激活，或者与凝血活酶试剂竞争结合因子VII而减慢凝血过程；另一方面，标本溶血会干扰凝血仪对反应终点的测量，从而影响凝血试验测试结果[6,7]。

Laga AC等[7]的结果表明，溶血标本所释放的基本上为游离形式，而非结合于微囊形式的血红蛋白，对凝血系统的活化作用有限；标本溶血可导致外源凝血途径活化轻度增高(FVIIa和F1+2水平轻度增高)，使临床溶血标本和机械诱导溶血标本的PT和APTT测试结果缩短，但影响程度较轻，对临床决定似乎无重要意义。Tang N等[12]报道，虽然机械诱导的溶血会干扰血栓弹力图的测定，但对常规凝血试验(PT、APTT和Fbg)的结果影响甚微，偏差低于美国临床实验室修正法案的允许范围。D'Angelo G等[13]也报道，即使严重溶血，对PT和APTT的测定影响很小，但导致Fbg的降低和D-dimer增高，这可能与他们制备溶血液时间过长以及采用冻融程序导致凝血激活有关。

Lippi G等[14]和La'ulu SL等[15]报道，机械诱导的溶血对D-dimer测定造成较小的负性影响。Lippi G等[14]认为，大多数轻度溶血样本的D-dimer测定结果可以发向临床。

我们的实验结果表明，临床溶血和重采未溶血配对标本的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP结果均无显著性差异，且均呈高度相关，Bland-Altman图显示以上指标的结果差值均较小，也即两者间的结果一致性良好；体外机械诱导溶血与临床溶血标本的结果类似，虽然对D-dimer测定造成较轻的负性影响(约降低10%)，但诱导溶血前后D-dimer结果高度相关，Bland-Altman图显示结果一致。这可能与机械诱导溶血对凝血系统的活化作用较弱[7]，以及溶血干扰比色法吸光度测定有关。同时也说明体外运输等机械因素导致的标本溶血对常规凝血试验、D-dimer和FDP的测定结果影响有限，不影响临床决定。

由于标本溶血是临床实验室的较常见现象，对溶血标本重新采集需耗费大量的人力、物力以及时间成本。基于标本溶血对常规凝血试验、D-dimer和FDP的测定结果影响有限，应对拒收溶血标本用于常规凝血测试的规定进行再评估。

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Theeffectofspecimenhemolysisonroutinecoagulationtestandfibrinolyticmarkerresults

NIEQun,DONGJing,NIELi-ping,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,DapengNewDistrictMaternalandChildrenHealthHospital,Shenzhen518120,China)

ObjectiveTo evaluate the effect of specimen hemolysis on routine coagulation test (including PT,APTT and Fbg) and fibrinolytic marker (including D-dimer and FDP) results.MethodsRoutine coagulation test and fibrinolytic marker were executed for 48 consecutive hemolyzed patient samples and paired re-collected (within 2 hours) nonhemolyzed specimens,and for randomly collected 30 nonhemolyzed specimens before and after mechanically induced hemolysis.ResultsIn 48 paired patients,there were no statistically significant differences in PT,APTT,Fbg,D-dimer and FDP results between hemolyzed and nonhemolyzed specimens,respectively.In 30 randomly collected specimens,significant differences were not seen in PT,APTT,Fbg and FDP values before and after induced hemolysis.Dimer decreased (361.10±493.40 vs 396.37±494.47 μg/L,P<0.001) after induced hemolysis.Pearson correlation analysis showed high correlation (allr>0.97,P<0.001),and Bland-Altman plot exhibited good agreement,in results of above-mentioned tests between hemolyzed and nonhemolyzed specimens.Differences in the results of above tests were not correlated with the degree of hemolysis (allP>0.05).ConclusionThere was no significant effect of specimens hemolysis on the results of routine coagulation test and FDP.Minor negative effect on D-dimer determination was seen in mechanically induced hemolyzed specimens in vitro,which is unlikely to be considered clinically meaningful.A policy of rejecting hemolyzed specimens for coagulation tests should be reevaluated.

hemolysis;routine coagulation test;D-dimer;FDP

深圳市科技创新委基础研究资助项目(JCYJ20150403091443282)

*通讯作者

1007-4287(2017)12-2115-04

R331.1

A

2017-06-15)