沈金花，陈剑霖

(中南民族大学 生命科学学院，医学生物研究所&武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074)

Linifanib和Tivozanib对肺癌细胞增殖的影响

沈金花，陈剑霖

(中南民族大学 生命科学学院，医学生物研究所&武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室，武汉430074)

为探讨小分子化合物Linifanib和Tivozanib对肺癌细胞A549和H358增殖的影响，以不同浓度Linifanib和Tivozanib预处理细胞48 h，用MTT法检测了细胞存活率，并通过流式细胞仪检测了细胞周期和凋亡情况，用RT-PCR检测了肿瘤抑制因子P21的mRNA表达量.结果表明：Linfanib和Tivozanib能抑制肺癌细胞的增殖，呈现剂量依赖性.Linifanib能诱导细胞凋亡，同时引起细胞周期在G2/M期阻滞.Tivozanib主要引起细胞周期在G2/M期阻滞.Linifanib和Tivozanib均能引起A549和H358细胞中P21的mRNA表达量显著升高，说明Linifanib和Tivozanib能抑制肺癌细胞A549和H358的增殖.

小分子化合物；肺癌细胞； 增殖

肺癌是全球范围内发病率和死亡率最高的疾病，每年约有156万人因肺癌死亡，其中85%均是非小细胞肺癌.早期患者可以通过手术进行治疗，但由于很多患者确诊时已是晚期，癌细胞已转移，有近40%的患者已无法用手术治疗.因此化疗是目前治疗非小细胞肺癌的主要手段.但化疗毒副作用大，化疗的肺癌患者5年存活率较低.因此，积极探索新的治疗肺癌的思路对临床医疗具有重要的意义.在肿瘤的生长过程中，血管起到了为癌细胞提供营养，促进肿瘤生长和增殖的功能.血管的生长与血管表皮生长因子受体(VEGFR)的激活密切相关.因此，抑制VEGFR的激活逐渐成为治疗肺癌的新思路.

Linifanib和Tivozanib均为新型的VEGFR的酪氨酸激酶抑制剂，其中Linifanib是氨基吲唑类尿素衍生物，对肝癌、乳腺癌、直肠癌等有明显的治疗效果[1].Tivozanib是Aveo公司和安斯泰来公司合作开发的高效抑制剂，目前主要用于肾癌的治疗[2].

Linifanib和Tivozanib是高效的VEFGR抑制剂，该药物已用于其他癌症的治疗.但是在肺癌上的应用鲜有报道.有研究表明VEGFR在肺癌细胞上高表达[3].故理论上VEGFR抑制剂对肺癌的增殖有一定的影响.期望本文通过研究Linifanib和Tivozanib对非小细胞肺癌细胞增殖和凋亡的影响，期望为肺癌的治疗提供新的思路.

1 材料与方法

1.1 试剂及样品

Linifanib 和 Tivozanib购自Selleckchem公司；MTT试剂购自Promega公司；碘化丙啶(PI)购自Biosharp公司；胎牛血清、RPMI-1640以及双抗均购自Hyclone公司.H358细胞株由武汉大学张晓东教授赠予，A549细胞株购自Procell公司.

1.2 实验仪器

酶标仪(Infinite200型, TECAN公司)，流式细胞仪(AriaⅢ型, BD公司)，Real-Time PCR System(7500fast型, Applied Biosystems)，核酸定量仪(Nanodrop 2000型, Thermo fisher Scientific公司)，核酸凝胶成像系统(Gel Doc XR+型, BIO-RAD公司)

1.3 细胞培养

H358和A549细胞株均用含有10%胎牛血清和1%双抗的RPMI-1640培养液，于37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养[4].

1.4 实验分组

实验分为7组：对照组，Linifanib低、中、高剂量组(2,5,10 μM)，Tivozanib低、中、高剂量组(2,10,20 μM).

1.5 MTT实验

分别接种3000个生长状态良好的H358和A549细胞于96孔板中，细胞贴壁后按照实验分组加入不同浓度药物，在培养箱中培养48 h后向每个孔加入10 μL MTT试剂，3 h后用酶标仪在490 nm波长下检测吸光值.取各平行孔吸光值的平均值，根据下列公式计算细胞存活率：存活率(%)=(实验组吸光度值/对照组吸光度值)×100 %(以不含细胞的培养液为空白组调零).

1.6 流式细胞术

分别接种6×105个生长状态良好的H358和A549细胞于60 mm培养皿中.细胞贴壁后按照实验分组加入不同浓度药物.在培养箱中培养48 h后收集细胞，PBS洗2次后加入70 %乙醇，-20 ℃下固定过夜后，用PI染色30 min.用流式细胞仪检测细胞周期.

1.7 逆转录-链式聚合酶反应(RT-PCR)

接种6×105个生长状态良好的H358和A549细胞于60 mm培养皿中，细胞贴壁后按照实验分组加入不同浓度药物，在培养箱中培养48 h后用Trizol法提取RNA，按RT-PCR试剂盒方法进行逆转录，反应结束后取4 μL的逆转录产物进行RT-PCR反应[5].

1.8 统计分析

采用Excel、CorelDRAW X4和Power Point 2013软件绘图，用t-检验法(student′st-test)对实验数据进行显著性差异比较，P<0.05，具有统计学意义.

2 结果与分析

2.1 Linifanib和Tivozanib对肺癌细胞增殖的影响

Linifanib和Tivozanib对肺癌细胞增殖的影响结果见图1.

**P<0.01,***P<0.001a) Linifanib处理A549细胞; b) Linifanib处理H358细胞; c) Tivozanib处理A549细胞; d) Tivozanib处理H358细胞图1 Linifanib和Tivozanib对A549和H358细胞增殖的影响Fig.1 Effect of Linifanib and Tivozanib on proliferation of A549 and H358 cells

由图1可见：2～10 μM Linifanib或2～20 μM Tivozanib处理细胞后，A549和H358细胞的增殖均受到抑制，细胞存活率随着药物浓度的升高而降低，且呈现剂量依赖性，具有统计学意义(P<0.05)，说明Linifanib和Tivozanib可以抑制A549和H358细胞的增殖.

2.2 Linifanib和Tivozanib对肺癌细胞周期的影响

用不同浓度Linifanib或Tivozanib分别处理A549或H358细胞后，通过流式细胞仪检测细胞周期和凋亡的情况，结果见图2.由图2可见：在一定浓度范围内，随着Linifanib浓度升高，凋亡细胞和G2/M期细胞的比例逐渐升高.随着Tivozanib浓度升高，G2/M期细胞的比例逐渐升高.说明Linifanib对肺癌细胞增殖的影响是通过诱导细胞凋亡和细胞G2/M期阻滞共同引起的.Tivozanib可以通过引起细胞G2/M期阻滞进而影响细胞增殖.

2.3 Linifanib和Tivozanib对肺癌细胞中P21 mRNA的影响

通过对调控细胞周期相关蛋白的mRNA表达量进行检测，发现用不同浓度Linifanib或Tivozanib分别处理A549和H358细胞后，在一定浓度范围内，随着药物浓度升高，实验组中P21的mRNA水平逐渐升高.而药物对Cyclin D1的mRNA表达没有显著影响.结果提示Linifanib和Tivozanib引起肺癌细胞的G2/M期阻滞是因为P21表达量升高，进而抑制与G2/M期相关的周期蛋白激活.

3 讨论

目前对抗癌药物的开发集中在靶向药物方面.EGFR是目前广泛研究的靶点之一.它是肺癌细胞膜表面高表达的蛋白，通过与外界配体结合，引发一系列生物学效应，如增殖、凋亡、分化和迁移等[6].因此可能通过抑制该蛋白的激活可以抑制细胞生长.现在最常见的治疗肺癌的靶向药物是EGFR酪氨酸激酶抑制剂.该类抑制剂在肺癌的治疗上取得了不错的临床效果[7].但是，单一的EGFR酪氨酸激酶抑制剂对肺癌的治疗效果有限，故本研究的靶点是另一个肺癌细胞膜表面高表达的蛋白VEGFR.VEGFR在肝癌、胃癌和结肠癌等癌症的治疗中已经得到普遍关注，针对该靶点设计的小分子化合物很多，其中如Sorafenib、Bevacizumab和Sunitinib等在癌症的治疗中取得了很好的效果[8,9].鉴于在肺癌细胞中也存在VEGFR高表达的现象，推测相关的小分子化合物对治疗肺癌也有一定的作用.实验以肺癌细胞系H358和A549细胞为对象，初步探讨了Linifanib和Tivozanib对肺癌细胞增殖和凋亡的影响.

研究分别从细胞水平和分子水平探究了小分子化合物对肺癌细胞A549和H358的影响.通过MTT实验发现Linifanib和Tivozanib能降低A549和H358细胞存活率.流式细胞术分析证明Linifanib能诱导细胞凋亡，同时引起细胞周期在G2/M期阻滞，Tivozanib主要引起细胞周期在G2/M期阻滞.RT-PCR检测发现 Linifanib和Tivozanib均可以引起A549和H358细胞中P21的mRNA表达量显著升高.以上结果说明了Linifanib和Tivozanib可以影响肺癌细胞A549和H358的增殖.

[1] Jasinghe V J, Xie Z, Zhou J, et al. ABT-869, a multi-targeted tyrosine kinase inhibitor, in combination with rapamycin is effective for subcutaneous hepatocellular carcinoma xenograft [J]. J Hepatol, 2008, 49(6): 985-997.

[2] Fishman M N, Srinivas S, Hauke R J, et al. Phase Ib study of tivozanib (AV-951) in combination with temsirolimus in patients with renal cell carcinoma [J]. Eu J Cancer, 2013, 49(13): 2841-2850.

[3] Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications [J]. S Oncology, 2002, 29(6 Suppl 16): 10-14.

[4] 王朝元， 刘亮亮.bHGA 对体外培养成骨细胞活性的影响[J].中南民族大学学报(自然科学版),2016,35(2):31-35.

[5] 陈思礼，吴汇兰，陈 洁.鱼腥藻 PCC7120 质粒上毒素-抗毒素基因对alr9029/asr9028 的初步研究[J].中南民族大学学报(自然科学版),2016,35(2):26-30.

[6] Hynes N E, Lane H A. ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors [J]. Nat Rev Cancer, 2005, 5(5): 341-354.

[7] Yang J C, Srimuninnimit V, Ahn M J, et al. First-line pemetrexed plus cisplatin followed by gefitinib maintenance therapy versus gefitinib monotherapy in East Asian never-smoker patients with locally advanced or metastatic nonsquamous non-small cell lung cancer: final overall survival results from a randomized phase 3 study [J]. J Thorac Oncol, 2016, 11(3): 370-379.

[8] Bellmunt J, Eisen T, Fishman M, et al. Experience with sorafenib and adverse event management [J]. Crit Rev Oncol Hematol, 2011, 78(1): 24-32.

[9] Boehm S, Rothermundt C, Hess D, et al. Antiangiogenic drugs in oncology: a focus on drug safety and the elderly - a mini-review [J]. Gerontology, 2010, 56(3): 303-309.

EffectofLinifanibandTivozanibonProliferationofLungCancerCells

ShenJinhua,ChenJianlin

( Institute for Medical Biology & Hubei Provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plant Germplasm in Wuling Area of China,College of Life Sciences, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

To investigate the effect of Linifanib and Tivozanib on the proliferation of lung cancer cell, A549 and H358 cells were treated with different concentrations of these compounds for 48 h and MTT assay was used to detect cell viability. Cell cycle and cell apoptosis were detected by flow cytometry analysis, and the mRNA expression of tumor-inhibiting factor P21 was tested by RT-PCR. The results showed that Linifanib and Tivozanib could inhibit the proliferation of lung cancer cells in a dose-dependent manner. Linifanib could induce cell apoptosis and arrest cell cycle in G2/M phase. Tivozanib could arrest cell cycle in G2/M phase. Meanwhile P21 mRNA expression in A549 and H358 cells increased after the Linifanib and Tivozanib treatment. It was concluded that Linifanib and Tivozaninb could inhibit the proliferation of lung cancer cell A549 and H358.

small molecule compounds; lung cancer cell; proliferation

2016-04-14

沈金花(1975-)，女，教授，博士，研究方向：疾病相关基因的功能研究，E-mail：shenjinhua2013@163.com

国家自然科学基金面上资助项目(31771274)；湖北省自然科学基金重点资助项目(2012FFA028)

Q291

A

1672-4321(2017)04-0036-04