吕瑶瑶，李若蹊，张延杰，夏 雨，王 娟

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510641；2.咀香园健康食品（中山）有限公司，广东 中山 528437）

佛手果低聚糖超声波辅助水浸提工艺研究

吕瑶瑶1，2，李若蹊1，张延杰2，夏 雨2，王 娟1

（1.华南理工大学食品科学与工程学院，广东 广州 510641；2.咀香园健康食品（中山）有限公司，广东 中山 528437）

利用超声波辅助水提取技术，以腌制佛手果为原料，考察提取时间、超声时间、提取温度、料液比对佛手果低聚糖提取得率的影响，采用正交试验对佛手果低聚糖的提取工艺进行优化，从单因素试验、正交试验结果以及节约能源角度，得出最佳工艺条件为：提取时间2 h，超声时间20 min，提取温度80℃，料液比1∶8，在此条件下，佛手果低聚糖得率为5.99（±0.15）%。采用体外结合胆酸盐实验评价佛手果低聚糖的降血脂功能，结果显示，佛手果低聚糖对胆酸钠（SC）、牛磺胆酸钠（STC）的吸附能力较强，其结合量分别为20.30（±0.39）、19.61（±0.71）μmol/mg，对甘氨胆酸钠（SGC）吸附能力较弱，其结合量只为14.38（±2.23）μmol/mg，提示佛手果低聚糖可能具有一定的降血脂功能。

佛手果；低聚糖；超声波；提取；降血脂

低聚糖（Oligosaccharide），又称寡糖，是由2～10个单糖通过末端的还原性羟基与其他单糖的羟基形成糖苷键，糖苷键缩聚连接形成的直链或支链的低度聚合糖［1］。低聚糖结构复杂，种类繁多，使低聚糖多样的功能有了分子结构上的解释，体现在生物的新陈代谢过程中［2］。低聚糖作为一种有着多种生理功能，热量低甜度小，对人体无毒副作用且生产原料充足的小分子物质有着极大的研究空间和研究潜力，其保健功能的开发有着无限前景，可作为新型保健食品的材料和添加剂，满足人们对保健品更细致和更养生的要求。

前人研究多侧重于佛手果多糖、挥发油和黄酮类物质［3-4］，对于佛手低聚糖的研究暂时是一片空白，而陈挚等［5］在胡芦巴调血脂研究时发现低聚糖在调血脂功能等多方面效果优于多糖。目前低聚糖物理提取手段有溶剂浸提法、超声波辅助浸提法、微波辅助浸提法、超高压辅助浸提法和膜分离法［6-8］。提取生物活性成分时，为了保留其活性和性质常常采用超声波［9］或超高压等提取温度较低，对成分保留较为完好的方法。本试验主要针对佛手果低聚糖的提取工艺方法及其降血脂功能，选择在超声波辅助下使用水浴浸提法进行研究，与传统水浴浸提法相比提取效率更高，并优化提取工艺。低聚糖含量测定使用苯酚-硫酸法，依据显色状况判断其糖种类，利用紫外分光光度计测定吸光值计算含量，研究不同工艺条件下低聚糖得率的变化［10］，并采用体外结合胆酸盐法测定佛手果低聚糖对3种胆酸盐的吸附量，初步研究其降血脂效果［11-12］，为佛手果低聚糖的进一步研究提供一定的数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

新鲜佛手果、腌制佛手果，均由广东展翠食品有限公司提供。

JY92-ⅡDN超声波细胞粉碎仪，宁波新芝生物股份有限公司；SHA-B恒温水浴振荡器，常州奥华仪器有限公司；SHZ-D（Ⅲ）循环水式真空泵，巩义市予华仪器公司；紫外/可见分光光度计，日本岛津公司；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；TDL-5-A离心机，上海安亭科学仪器厂；RE-52AA真空旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；JA1003电子天平，上海精密科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 佛手果低聚糖提取 按照一定的料液比将佛手果与水混合，提取（超声波辅助水浸提，超声波功率650 W），离心、抽滤去除果渣，旋蒸浓缩，浓缩至原体积1/4左右，servage法去除蛋白质，4倍体积无水乙醇沉淀，去除脂类、多糖，静置，离心（3 000 r/min，15 min），收集上清液，旋蒸浓缩，浓缩液即为佛手果低聚糖粗提取液［8，13］。

1.2.2 低聚糖含量测定［14-15］采用苯酚-硫酸法对低聚糖进行测定。其原理是样品溶液中的可溶性糖与浓硫酸反应脱水后，生成糖醛或糖醛衍生物。糖醛衍生物能与苯酚发生缩合反应，生成有色物质。样品中糖种类不同可呈现不同颜色反应—单糖可反应显紫红色，低聚糖则呈棕黄色。在490 nm处己糖有最大吸收峰，吸收值与糖含量呈线性关系，据此可测得所含低聚糖量，并根据其颜色不同确定糖种类［14-15］。

标准曲线的绘制：称取干燥的105℃无水葡萄糖150 mg于500 mL容量瓶中，配制成0.30 mg/mL标准葡萄糖溶液，按表1配制成阶梯浓度的葡萄糖标准溶液，以2.0 mL蒸馏水作为空白对照。

表1 葡萄糖标准溶液的配制

每支试管中加入6%苯酚溶液1.0 mL，混匀后迅速加入7.0 mL浓硫酸，立即置于冷水浴中。20 min后于490 nm处测定吸光值，绘制标准曲线，见图1。

图1 葡萄糖标准曲线

得回归方程：y = 10.94x + 0.017，R2=0.999，表明在490 nm波长下，吸光度值与葡萄糖含量有良好的线性关系。

样品溶液的测定：将所获得的粗沉淀溶解于250 mL蒸馏水，吸取5 mL于100 mL容量瓶中配制成样品溶液。准确吸取样品溶液0.5 mL于20 mL具塞试管中，用蒸馏水补充至2.0 mL。向试管中分别加入1.0 mL 6%的苯酚溶液后摇匀，再迅速加入浓硫酸7.0 mL，并将试管置于冷水浴中冷却。取2.0 mL蒸馏水于试管中依次加入苯酚和硫酸溶液作为空白对照。待20 min后即可于490 nm波长处测定样品的吸光度。每组样品测量两次取平均值。依据标准曲线计算样品溶液中的低聚糖含量，得出低聚糖得率：

1.2.3 佛手果低聚糖提取的单因素试验 选取料液比、浸提温度、超声时间、提取时间进行单因素试验，考察这些因素对佛手果低聚糖提取效果的影响［16］。

1.2.4 佛手果低聚糖提取的正交试验 在单因素试验基础上，采用4因素3水平按L9（34）正交设计优化佛手果低聚糖的提取工艺，各因素及水平设计如表2所示，每个处理3次重复［17-18］。

表2 佛手果低聚糖提取正交试验因素水平

1.2.5 降血脂功能测定 采用所测定目标成分对胆酸盐吸附率的方法表示低聚糖降血脂的能力。移取0.5 mL低聚糖粗糖液于试管中，用pH=6.8的磷酸缓冲液补至2 mL；并以2 mL磷酸缓冲液为空白对照，分别加入2 mL胆酸盐（牛磺胆酸钠STC、甘氨胆酸钠SGC、胆酸钠SC）溶液，37℃恒温振荡1 h，离心（4 000 r/min，20 min），取1.5 mL上清液于具塞试管中，加入4.5 mL 60%的硫酸溶液混合均匀，70℃水浴20 min，冰浴5 min，紫外分光光度计387 nm处测定吸光度，3次重复［19］。

图2 胆酸盐的标准曲线

标准曲线绘制：准确分别称量胆酸钠（SC）、牛磺胆酸钠（STC）、甘氨胆酸钠（SGC）各0.0216、0.0268、0.0244 g于50 mL容量瓶中，配制成1 μmol/mL标准胆酸盐溶液，按表配制成阶梯浓度的胆酸盐标准溶液。以1.5 mL缓冲液作为空白对照。所得标准曲线见图2，得胆酸钠（SC）标准曲线为y = 2.828x + 0.008，R2= 0.994。牛磺胆酸钠（STC）的标准曲线为y =1.757x + 0.063，R2=0.997。甘氨胆酸钠（SGC）的标准曲线为y = 2.356x + 0.003，R2=0.996。

表3 胆酸盐标准溶液的配制

2 结果与分析

2.1 佛手果低聚糖提取单因素试验

2.1.1 提取时间对佛手果低聚糖的影响 称取30 g腌制佛手果于500 mL烧杯中，选取料液比1∶10 g/mL，浸提温度80℃，超声时间10 min，测定提取时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5和3.0 h时佛手果低聚糖的得率，结果见图3。由图3可知，当提取时间在1～3 h时，佛手果低聚糖的得率随提取时间的延长不断升高，当提取时间为2.5 h时，低聚糖得率达到最高、为3.40%，随后呈现下降趋势。提取时间越长，原料中的成分在溶剂中溶解和扩散得越充分和完全，提取率越高。但成分量是一定的，当扩散达到平衡后提取率不再增加。此时若再延长提取时间，反而会使杂质增多，使目标成分的溶出受到影响，且提取效率较低，造成能源浪费。

图3 不同提取时间的低聚糖得率

2.1.2 超声时间对佛手果低聚糖的影响 称取30 g腌制佛手果于500 mL烧杯中，选取料液比1∶10 g/mL，浸提温度80℃，提取时间2 h，测定超声提取时间5、10、15、20和25 min时佛手果低聚糖的得率，结果如图4所示。由图4可知，在5～25 min超声时间范围内提取时，佛手果低聚糖得率先随超声时间的延长逐渐增加，当超声时间为15 min时低聚糖得率最高、为2.02%，随后呈下降趋势。超声时间在20、25 min时，低聚糖得率没有显著差异。随着超声时间增加，细胞被破碎的愈加完全，成分的溶出更加彻底，而低聚糖得率增加。当扩散平衡后，增加超声时间也不会继续增加成分的溶出。超声时间过长会使溶液中杂质增多阻碍糖分溶出，同时随着溶液温度上升，剧烈的波动可能导致成分破坏，导致低聚糖得率略有下降，造成能源浪费。

图4 不同超声时间的低聚糖得率

图5 不同提取温度的低聚糖得率

2.1.3 提取温度对佛手果低聚糖的影响 称取30 g腌制佛手果于500 mL烧杯中，选取料液比1∶10 g/mL，提取时间2 h，超声时间10 min，测定提取温度 40、50、60、70、80℃时佛手果低聚糖的得率，结果见图5。由图5可知，在40～80℃提取时，佛手果低聚糖得率随提取温度的提高呈上升趋势，提取温度为80℃时低聚糖得率最高、为2.52%，但与70℃时的得率没有显著性差异。温度的提高有助于细胞内成分更快地扩散到溶剂中，增加糖分在溶剂中的溶解率。当温度达70℃后，继续升温对低聚糖得率的增加不明显。

2.1.4 料液比对佛手果低聚糖的影响 称取30 g腌制佛手果于500 mL烧杯中，选取提取时间2 h，浸提温度80℃，超声时间10 min，料液比分别为 1∶4、1∶6、1∶8、1∶10和 1∶12时佛手果低聚糖的得率，结果见图6。由图6可知，在1∶4～1∶12料液比范围内提取时，佛手果低聚糖得率随料液比的降低呈先升高再下降随后趋于平缓的趋势。当料液比为1∶6时，低聚糖得率最高、为1.78%。溶剂用量增加，增大了佛手果与溶剂的接触面积，有利于佛手果低聚糖在溶剂中的溶解。但料液比过小，即溶剂用量过多，会导致后续旋转蒸发去除溶剂时耗时过长，使低聚糖遭到破坏。同时溶剂用量过多会使佛手果飘浮在溶剂表面，超声时，超声波经过溶剂的反射后能量较弱，导致超声对佛手果的作用减弱，造成低聚糖得率降低。

图6 不同料液比的低聚糖得率

2.2 佛手果低聚糖提取正交试验

由表4可知，测超声波辅助水浴提取佛手果低聚糖的得率受4种因素影响，由R值RB＞RA＞RC＞RD（即1.07＞0.62＞0.58＞0.57）判断，得影响因素B＞A＞C＞D（即超声时间＞提取时间＞提取温度＞料液比）。所得最佳低聚糖提取工艺条件为A2B3C3D3，即提取时间2.5 h，超声时间20 min，提取温度80℃，料液比1∶8。该组合不存在于原实验组中，按优化参数做验证实验，结果显示在该工艺条件下低聚糖得率为5.99（±0.15）%，为最佳提取工艺条件。

表4 佛手果低聚糖提取条件正交试验结果

2.3 降血脂功能结果分析

腌制佛手低聚糖粗品与胆酸盐结合量的结果如下：与胆酸钠（SC）的结合量为20.30（±0.39）μmol/mg低聚糖；与牛磺胆酸钠（STC）的结合量为19.61（±0.71）μmol/mg低聚糖；与甘氨酸钠（SGC）的结合量为14.38（±2.23）μmol/mg低聚糖。

由上可知，佛手果的低聚糖对甘氨胆酸钠（SGC）吸附能力最弱［20］，而对胆酸钠（SC）和牛磺胆酸钠（STC）无明显差别，其吸附能力SGC＜SC≈STC。而佛手低聚糖对胆酸盐的结合量，与夏雨等［10］测量的佛手果多糖相比可发现，低聚糖对胆酸盐有较好的吸附效果，其吸附能力与佛手黄酮相当，与陈挚等［5］先提取胡芦巴多糖，再加入纤维素酶进行降解得到胡芦巴低聚糖所得出的低聚糖在调血脂功能等多方面效果优于多糖结论相似。说明佛手低聚糖有较好的降低胆固醇含量的效果，可能具有较强的降血脂能力，还需要后续实验验证。

3 结论与讨论

本试验采用单因素和正交试验对佛手果低聚糖的提取工艺进行优化，结果表明，4个因素对低聚糖提取效果的影响由大到小依次为：超声时间＞提取时间＞提取温度＞料液比；正交试验结果表明，佛手果低聚糖提取的最佳工艺条件为提取时间2.5 h，超声时间20 min，提取温度80℃，料液比1∶8，此时提取的佛手果低聚糖得率最高、为5.99（±0.15）%，但与在试验号3工艺条件下提取的得率没有显著性差异，因此从节约能源角度考虑，选择提取时间2 h、超声时间20 min、提取温度80℃、料液比1：8为最佳工艺条件。

本试验还采用体外结合胆酸盐试验对佛手果低聚糖降血脂［21］能力进行评价，结果表明佛手果低聚糖对胆酸盐具有一定的吸附力，具有一定的降血脂功能。本试验对于降血脂功能的测定采取了体外实验的胆酸盐结合法，但对于生物是否真的有降血脂功效，需要进一步的动物实验验证［22］。

［1］ 刘兰花，姜竹茂，刘云国，等. 功能性低聚糖的制备、功能及应用研究进展［J］. 中国食品添加剂，2015（12）：158-166.

［2］ 王乃强. 我国低聚糖的研发现状与前景［J］. 精细与专用化学品，2007（12）：1-5.

［3］ 严玮. 佛手化学成分和药理作用研究进展［J］.实用中医药杂志，2015（31）：788-790.

［4］ 杨继，叶安，陆智明，等. 金佛手果叶多糖的体外抗氧化活性研究［J］. 东南园艺，2015（4）：7-10.

［5］ 陈挚，雷亚亚，黑晶，等. 胡芦巴多糖及低聚糖调血脂活性研究［J］. 中草药，2015，46（8）：1184-1189.

［6］ 赵迎春，卢家炯. 超声波辅助提取雪莲果中低聚果糖及其纯化的初步研究［J］. 广西轻工业，2010（1）：1-8.

［7］ 周泉城. 超声波辅助提取经膨化大豆粕中低聚糖工艺［J］. 农业工程学报，2008，24（5）：245-249.

［8］ 唐雪娟. 香蕉低聚糖的分离、结构鉴定及品种比较［D］. 广州：华南理工大学，2014.

［9］ 陈文超，张锦华，叶峥，等. 响应面法优化超声波辅助提取苹果渣低聚糖的工艺［J］. 食品工业科技，2017（12）：278-286.

［10］ 夏雨，王雁胜，张延杰，等. 佛手果营养与活性成分测定及降血脂功能研究［J］. 食品科技，2016（2）：70-73.

［11］ 张沛然，郭改会. 高血脂症的中西医临床诊治［J］. 中国临床医生，2012，40（3）：18-20.

［12］ 许丽萍，柳毅. 高血脂症的防治［J］. 中国医药指南，2013（9）：793-794.

［13］ 姚飞，张向前. 陕北木枣中低聚糖的提取及其功效研究［D］. 延安：延安大学，2015.

［14］ 廖春龙，邱奇琦，印遇龙等. 薄层色谱-苯酚-硫酸法分析大豆低聚糖中棉籽糖含量［J］. 食品科学，2010（16）：200-203.

［15］ 赵宁，问亚琴，潘秋红. 苯酚-硫酸法测定干红葡萄酒中的多糖含量［J］. 中外葡萄与葡萄酒，2011（5）：9-12.

［16］ 王振斌，刘加友，马海乐，等. 无花果多糖提取工艺优化及其超声波改性［J］. 农业工程学报，2014，30（10）：262-269.

［17］ 蒋梅峰，林勤保. 大枣低聚糖的分离纯化及结构分析［J］. 食品科学，2008（8）：376-378.

［18］ 陈宏阳. 人参低聚糖提取分离纯化及活性研究［D］. 长春：吉林农业大学，2013.

［19］ 邓志汇，黄惠华. 茶鲜叶和茶花水提液对胆酸盐的结合及其降血脂机理的研究［J］. 食品科学，2011（19）：96-99.

［20］ 赵秀玲. 佛手生理活性成分的研究进展［J］. 食品工业科技，2012（21）：393-399.

［21］ 颜腾龙，易有金. 药食两用中药降血脂作用研究进展［J］. 食品安全质量检测学报，2014（3）：934-941.

［22］ Vincenzo Mollace ，Hypolipemic and hypoglycaemic activity of bergamot polyphenols：From animal models to human studies［J］. Fitoterapia，2011（82）：309-316.

Study on ultrasonic assistant water extraction processing of Bergamot oligosaccharides

LYU Yao-yao1，2，LI Ruo-xi1，ZHANG Yan-jie2，XIA Yu2，WANG Juan1
（1. School of Food Science and Engineering，South China University of Technology，Guangzhou 510641，China；2.Juxiangyuan Health Food （ZhongShan） Co.，Ltd. ，Zhongshan 528437，China）

Using preserved Bergamot as raw material，the extraction technology of ultrasonic assisted-water was studied. To optimize the extraction process of bergamot oligosaccharides technology，extraction time，ultrasonic time，extraction temperature，ratio of material to watek chosen as factors which affected the extraction rate by orthogonal test. Considering the results of single factor experiment，orthogonal experiment results and energy conservation，the optimum extraction technology was as follows: extraction time 2 h，ultrasonic time 20 min，extraction temperature 80℃，and ratio of material to water 1∶8. The yield of bergamot oligosaccharide can reach 5.99（±0.15）% under these conditions. The capabilities of bergamot oligosaccharide which reduced blood lipid function was estimated as index by bile salt-binding experiment. The results suggested that bergamot oligosaccharide presented stronger binding ability to sodium cholate （SC），sodium taurocholate （STC），which accounted for 20.30（±0.39）μmol/mg，19.61（±0.71）μmol/mg，respectively，while it presented weaker binding ability to glycocholate（SGC），which accounted for 14.38（±2.23）μmol/mg. Therefore，bergamot oligosaccharide have function of reducing blood lipid.

bergamot；oligosaccharides；ultrasonic；extraction ；lowering blood lipid

S666.9

A

1004-874X（2017）08-0106-07

吕瑶瑶，李若蹊，张延杰，等. 佛手果低聚糖超声波辅助水浸提工艺研究［J］.广东农业科学，2017，44（8）：106-112.

2017-03-06

广东省产学研合作项目（2014B090904044，2016B090918093）

作者简介：吕瑶瑶（1988-），女，硕士，工程师，E-mail：881003yy@163.com

王娟（1981-），女，博士，副教授，E-mail：wangjuan@scut.edu.cn

（责任编辑 白雪娜）