刘忠梅，罗 佳，潘仲乐，刘洪义，李丹丹，韩政坤，魏冬旭，马 微

(1.黑龙江出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，黑龙江 哈尔滨 150001； 2.辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001； 3.海南出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，海南 海口 570125；4.东宁出入境检验检疫局，黑龙江 东宁 157299)

应用DPO技术检测番茄斑萎病毒方法的建立

刘忠梅1，罗 佳2，潘仲乐1，刘洪义1，李丹丹3，韩政坤1，魏冬旭1，马 微4

(1.黑龙江出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，黑龙江 哈尔滨 150001； 2.辽宁出入境检验检疫局，辽宁 大连 116001； 3.海南出入境检验检疫局 检验检疫技术中心，海南 海口 570125；4.东宁出入境检验检疫局，黑龙江 东宁 157299)

为了准确、高效地检出番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)，利用双启动寡核苷酸引物(DPO)技术，以TSWV外壳蛋白(CP)基因为靶基因，设计了一对DPO引物，对PCR反应体系中的引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶用量进行优化，建立了TSWV的DPO-PCR检测方法，并对其灵敏度、特异性以及退火温度敏感性进行了评价。结果表明，应用DPO引物建立的PCR技术能够成功地扩增出TSWV的208 bp特异性条带，与预期目标相符。经过优化后，DPO-PCR反应体系(25 μL)为：DNA 模板1 μL，10×Buffer (含Mg2+) 2.5 μL，dNTPs(每种2.5 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，上、下游DPO引物(20 μmol/L)各1.0 μL，以去离子水补充至25 μL。利用该检测方法，在49.8～70.0 ℃的退火温度范围内，均可实现目标基因片段的高效扩增，说明其对退火温度不敏感；利用病毒RNA进行检测，该方法的灵敏度为7.5 ng；通过对TSWV、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和番茄黑环病毒的检测表明，仅TSWV呈现阳性反应，说明该方法特异性强。所建立的DPO-PCR检测方法能够准确、高效地检测TSWV，可用于进出境种苗检疫筛查及田间病害诊断。

番茄斑萎病毒； 双启动寡核苷酸引物； DPO-PCR； 检测

番茄斑萎病是1915年在澳洲番茄上首次发现的，其病原于1930年被命名为番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV)[1]。该病毒为世界性分布，特别是热带、温带和亚热带地区比较常见[2]。其寄主范围广，可侵染80科1 000多种植物，其中包括番茄、烤烟、辣椒、花生等作物，也包括非洲紫罗兰、万寿菊等多种观赏植物[3-4]。TSWV在全世界范围内都导致了重大的农业经济损失[5]。据报道，该病毒曾造成澳大利亚花生产量损失高达90%，印度花生产量损失达80%[6]；也曾造成夏威夷生菜和番茄产量亏损50%～90%[7]；而在法国和西班牙等欧洲地区，随着传播介体蓟马的定殖与扩散，该病毒能够对番茄、辣椒等造成毁灭性危害，损失最高可达100%[8]。因此，TSWV被列为世界危害最大的10种植物病毒之一[9]。TSWV可以通过汁液接种、种子传染，蓟马也能传播。感病种苗的贸易是该病毒远距离传播的方式之一。TSWV是《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》中列明的有害生物，也是欧洲及地中海植物保护组织(EPPO)检疫性有害生物。建立该病毒快速、精准的检测方法，能有效地阻止外来种苗携带的病毒入侵，保护我国的农业生产。

双启动寡核苷酸引物(DPO)技术2007年由韩国的Seegene公司首次研制成功[10]，应用于感染性疾病诊断，极大地提高了PCR的敏感性和特异性。Kommedal等[11]在人类临床标本细菌16S rRNA研究中，通过试验证实DPO的设计可以防止DNA的交叉反应所产生的假阳性和假阴性。刘梅等[12]将该技术应用于马铃薯病毒的检测，表明其特异性强和敏感度高。徐义刚等[13]将该技术应用于食源性致病菌大肠杆菌O157∶H7的检测，可以有效阻断非特异性扩增从而避免了假阳性的检测结果，显示出其特异性强。本研究拟采用DPO技术，建立特异性检测TSWV的DPO-PCR方法，为进出境种苗检疫筛查及田间病害诊断提供良好的检测手段。

1 材料和方法

1.1 材料

TSWV、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和番茄黑环病毒的阳性材料均由中国检验检疫科学研究院提供。

M-MLV反转录酶为Promega公司产品，RNasin、 dNTPs、TaqDNA聚合酶和100 bp DNA Ladder(Dye Plus)为大连宝生物(TaKaRa)公司产品，核酸提取试剂为Qiagen RNeasy Plant Mini Kit。

1.2 引物设计与合成

根据TSWV 外壳蛋白(CP)基因的保守序列，设计了普通引物以及DPO引物(表1)，均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 引物序列及产物大小

1.3 总RNA提取

称取100 mg TSWV阳性材料，用Qiagen RNeasy Plant Mini Kit提取总RNA，用ND-1000超微量分光光度计测定其浓度。

1.4 反转录

反转录体系20 μL：先加入2 μL总RNA、9 μL DEPC水，70 ℃保温5 min，冰上放置2 min；再加入4 μL 5×Buffer、2 μL dNTPs (10 mmol/L)、0.5 μL Oligo(dT)18(100 μmol/L)、1 μL Random 6 mer(100 μmol/L)、0.5 μL RNasin (40 U/μL )、1 μL M-MLV (200 U/μL)，42 ℃保温1 h。95 ℃灭活5 min，放置冰上待用。

1.5 DPO-PCR反应

DPO-PCR反应体系25 μL：dNTPs(每种2.5 mmol/L)用量范围为0.01～5.0 μL,TaqDNA聚合酶(5 U/μL)用量范围为0.001～0.5 μL,DPO引物(上、下游引物各20 μmol/L)用量范围为0.05～2.0 μL，10×Buffer(含Mg+)2.5 μL，模板1 μL，以ddH2O补充至25 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、60 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s,35个循环；72 ℃ 10 min。反应结束后，取5 μL扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，并记录结果。

1.6 DPO-PCR退火温度敏感性试验

将DPO-PCR退火温度范围设为49.8～70.0 ℃，用DPO引物进行扩增试验，以普通PCR引物作为参照，经琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果。

1.7 DPO-PCR灵敏度试验

分别取TSWV样品总RNA 5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025 μL作为反转录模板，进行RT-PCR，对DPO-PCR的灵敏度进行测定。

1.8 DPO-PCR特异性试验

取TSWV、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和番茄黑环病毒等4种均能侵染茄科植物的检疫性病毒的cDNA作为模板，同时用健康马铃薯植株叶片作阴性对照，分析DPO-PCR的特异性。

2 结果与分析

2.1 TSWV DPO-PCR检测方法的建立

基于DPO引物设计方法，以TSWV CP基因的保守序列为靶序列，设计了一对DPO引物，经反应体系优化，建立TSWV的DPO-PCR检测方法。从图1a可以看出，随着dNTPs加入量的增加，扩增到的目的条带逐渐变亮，当加入量为2.0 μL时达到最亮，之后不再随加入量的增加而增强。从图1b可以看出，TaqDNA聚合酶加入量与PCR扩增效率呈正相关，当加入量为0.2 μL时足以有效地扩增到目标条带。从图1c可以看出，随着引物量的减少，扩增的目标条带总体上越来越弱，当加入量为1.0 μL时扩增效果最佳。因此，TSWV DPO-PCR检测方法中最优化的反应体系(25 μL)为：DNA 模板1 μL，10×Buffer (含Mg2+) 2.5 μL，dNTPs(每种2.5 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，上、下游DPO引物(20 μmol/L)各1.0 μL，以去离子水补充至25 μL。采用该最优体系检测TSWV阳性样品，可以有效地扩增到目标条带(图1d)。

a.dNTPs(每种2.5 mmol/L)用量优化，其中，M:100 bp DNA Ladder(下同);1—9:dNTPs用量分别为0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μL。b.Taq DNA聚合酶(5 U/μL)用量优化，其中，1—9:Taq DNA聚合酶用量分别为0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 μL。c.DPO 引物(20 μmol/L)用量优化，其中，1—6:DPO 引物用量分别为2.0、1.0、0.5、0.25、0.1、0.05 μL。d.TSWV DPO-PCR最优化的反应体系，其中，1—2:DPO-PCR反应结果

2.2 TSWV DPO-PCR检测方法退火温度敏感性试验结果

图2结果显示，所建立的DPO-PCR方法在49.8～70.0 ℃的退火温度范围内均能进行高效率的扩增，且扩增效率基本保持一致，说明DPO引物的退火温度范围较宽；而普通PCR方法则存在最适退火温度。

M:100 bp DNA Ladder;1—9:退火温度分别为49.8、51.5、53.4、58.3、61.0、63.7、66.1、68.0、70.0 ℃,其中，左边1—9泳道为普通PCR结果，右边1—9泳道为DPO-PCR结果

2.3 TSWV DPO-PCR检测方法灵敏度试验结果

经分光光度计测定，提取的TSWV样品总RNA质量浓度为150 ng/μL。对不同用量的总RNA进行反转录，然后采用DPO-PCR方法扩增检测，结果表明，随着反转录模板用量的降低，目标条带逐渐变弱。当总RNA取5～0.05 μL时，DPO-PCR均能扩增到目标条带，而总RNA取0.025 μL时，DPO-PCR不能扩增到目标条带(图3)。因此，利用建立的DPO-PCR方法能有效地检出7.5 ng 的TSWV RNA，该方法的检测灵敏度为7.5 ng。

M:DL2000 DNA Marker;1—8:分别取5、2.5、1、0.5、0.25、0.1、0.05、0.025 μL TSWV RNA作为模板，进行反转录和DPO-PCR反应

2.4 TSWV DPO-PCR检测方法特异性试验结果

利用建立的DPO-PCR方法检测4种供试植物病毒，结果表明，以TSWV cDNA为模板能够扩增出208 bp条带，与预期目标条带大小一致，而其他病毒阳性材料和阴性对照均未扩增到目的条带，且无非特异性扩增(图4)，说明本研究建立的TSWV DPO-PCR检测方法特异性强。

M:DL2000 DNA Marker;1—4:分别取TSWV、番茄环斑病毒、烟草环斑病毒和番茄黑环病毒的cDNA作为模板，进行DPO-PCR反应；5：阴性对照

3 结论与讨论

植物检疫是种传病害风险管理中一个重要的措施，各国政府制定相应的政策法规对种苗健康进行检测和管理，阻止外来病原物(病毒、真菌、细菌等)的进入，保护本国的农业生产。随着种苗调运和国际种苗贸易的迅速发展，植物病毒检疫在国际种苗贸易中受到越来越多的重视，研究一些快速、准确、灵敏的种苗病毒检疫技术成为各国植物检疫技术研究的重点。目前，TSWV快速检测最常见的方法是普通PCR和实时荧光定量PCR。引物设计是制约该类检测方法成败的关键性因素[14-15]。本研究引入一种利用DPO引物的PCR技术，用于检测TSWV。与普通PCR引物和实时荧光定量PCR引物相比，DPO引物设计简单，不需要反复比对引物的特异性，也不需要优化引物的各项参数与反应条件。本研究还表明，采用DPO-PCR方法检测TSWV时，在49.8～70.0 ℃的退火温度下，均能保持高效扩增，不同于普通PCR和实时荧光定量PCR需要选择最适的退火温度。因此，DPO-PCR大大地简化了引物设计、试验操作，且节约成本。经过对引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶用量的优化，建立了TSWV DPO-PCR反应体系(25 μL)：DNA 模板1 μL，10×Buffer (含Mg2+) 2.5 μL，dNTPs(每种2.5 mmol/L)2.0 μL，TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，上、下游DPO引物(20 μmol/L)各1.0 μL，以去离子水补充至25 μL。采用该最优体系检测TSWV阳性样品，可以有效地扩增到目标条带。

DPO引物中加入了多聚次黄嘌呤(polyI)，该多聚次黄嘌呤由弱的氢键连接，所以它比其他碱基的熔点低，同时多聚次黄嘌呤把DPO引物分成了两部分，起到了固定作用并决定着引物的特异性延伸。由于DPO引物特殊的结构，使其自身或者引物之间很少形成发夹结构或二级结构，提高了扩增效率，DPO引物与模板发生错配的概率很小，一旦有3个以上碱基错配，就不会成功扩增，保证了扩增的特异性[16-17]。本研究中特异性试验结果表明，DPO技术能准确地鉴定出目标植物病毒，其他植物病毒无交叉反应和非特异性反应。该技术显示出了良好的可靠性和实用性，为TSWV的准确检测提供了新手段，为种苗调运和国际种苗贸易的迅速发展提供了技术保障。

[1] 洪霓.番茄斑萎病毒的检疫技术[J].植物检疫,2006,20(6):389-392.

[2] German T L,Ullman D E,Moyer J W.Tospoviruses:Diagnosis,molecular biology phylogeny and vector relationships[J].Annual Review of Phytopathology,1992,30:315-348.

[3] Momol M T,Funderburk J E,Olson S,etal.Management of TSWV on tomatoes with UV-reflective mulch and acibenzolar-S-methyl[C]//Thrips and tospoviruses:Proceeding of the 7th international symposium on Thysanoptera.Italy:CSIRO Publisher,2001:111-116.

[4] 郑元仙,刘雅婷.番茄斑萎病毒属病毒检测技术研究进展[J].云南农业大学学报,2009,24(4):607-613.

[5] Whitfield A E,Ullman D E,German T L.Tospoviruses-thrips interactions[J].Annu Rev Phytopathol,2005,43:459-489.

[6] Ghanekar A M,Reddy D V R,Lizuka N,etal.Bud necrosis of groudnut(ArachishypogaeaL.)in India caused by tomato spotted wilt virus[J].Annals of Applied Biology,1979,93:173-179.

[7] Cho J J,Mau R F L,Mitchell W C,etal.Host list of plants susceptible to tomato spotted wilt virus (TSWV) [J].Research Extension Series,1987,78:1-12.

[8] 洪霓,高必达.植物病害检疫学[M].北京：科学技术出版社,2005:120-123.

[9] Scholthof K B G,Adkins S,Czosnek H,etal.Top 10 plant viruses in molecular plant pathology[J].Molecular Plant Pathology,2011,12(9):938-954.

[10] Chun J Y,Kim K J,Hwang I T,etal.Dual priming oligonucleotide system for the multiplex detection of respiratory viruses and SNP genotyping ofCYP2C19 gene[J].Nucleic Acids Research,2007,35:40-46.

[11] Kommedal O,Simmon K,Karaca D,etal.Dual-priming oligonucleotides for broad-range amplification of the bacterial 16S rRNA gene directly from human clinical specimens[J].Journal of Clinical Microbiology,2012,50(4):1289-1294.

[12] 刘梅,黄新,马占鸿,等.应用DPO引物检测马铃薯病毒的多重RT-PCR技术研究[J].植物病理学报,2009,39(4):431-434.

[13] 徐义刚,李丹丹,崔丽春,等．应用DPO-PCR技术检测肠出血性大肠杆菌O157∶H7[J].食品科学,2014,35(8):160-164.

[14] 徐义刚,李丹丹,刘忠梅,等.产肠毒性大肠杆菌DPO-PCR检测方法的建立与应用[J].中国生物工程杂志,2013,33(11):75-80.

[15] 辛言言,刘洪义,杨长志,等.番茄黑环病毒RT-LAMP检测方法的建立[J].河南农业科学,2015,44(4):88-92.

[16] Bergstrom D E,Zhang P,Johnson W T.Comparison of the base pairing properties of a series of nitroazole nucleobase analogs in the oligodeoxyribonucleotide sequence 5′-d(CGCXAATTYGCG)-3′[J].Nucleic Acids Research,1997,25:1935-1942.

[17] Woo H Y,Park H,Kim B I,etal.Evaluation of dual priming oligonucleotide-based multiplex PCR for detection of HBV YMDD mutants[J].Arch Virol,2008,153(11):2019-2025.

Development of DPO-PCR Detection Method for Tomato Spotted Wilt Virus

LIU Zhongmei1,LUO Jia2,PAN Zhongle1,LIU Hongyi1,LI Dandan3,HAN Zhengkun1,WEI Dongxu1,MA Wei4

(1.Technical Centre of Heilongjiang Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Harbin 150001,China;2.Liaoning Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Dalian 116001,China; 3.Technical Centre of Hainan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Haikou 570125,China; 4.Dongning Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Dongning 157299,China)

In order to accurately and efficiently detect tomato spotted wilt virus(TSWV),in this study,a pair of dual-priming oligonucleotide(DPO) primers was designed based on TSWV coat protein(CP) gene by DPO technology and through optimization of reaction system factors including concentrations of primer,dNTPs andTaqDNA polymerase,a DPO-PCR detection method for TSWV was established.Its sensitivity,specificity and annealing temperature sensitivity were also evaluated.The results showed that the expected fragment of 208 bp was successfully amplified by the DPO-PCR system.The optimal DPO-PCR system(25 μL) was as follows:DNA 1 μL，10×Buffer (Mg2+Plus ) 2.5 μL，dNTPs(2.5 mmol/L for each)2.0 μL，TaqDNA polymerase(5 U/μL)0.2 μL，each primer(20 μmol/L)1.0 μL，with deionized water to supplement the system.The target gene could be efficiently amplified by the DPO primers in the annealing temperature range from 49.8 ℃ to 70.0 ℃,showing that the method was insensitive to annealing temperature.The detection sensitivity of the method was 7.5 ng when viral RNA was used as template.TSWV,tomato ringsopt virus,tobacco ring spot virus and tomato black ring virus were simultaneously detected by the method,and positive reaction appeared only for TSWV,indicating that the method had strong specificity.The established method can detect TSWV accurately and efficiently,and thus can be used for quarantine screening and disease diagnosis of entry and exit seedlings.

tomato spotted wilt virus; dual-priming oligonucleotide; DPO-PCR; detection

S432.4+1

A

1004-3268(2017)11-0093-05

2017-05-13

哈尔滨市科技创新人才研究专项(2012RFQQN029)；国家质检总局科技计划项目(2013IK051)

刘忠梅(1976-)，女，山东莱州人，高级农艺师，博士，主要从事植物检疫工作。E-mail:liuzhmei@163.com