王秋颖，薛东齐，陈秀玲，李景富，王傲雪,*

(1.东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030； 2.东北农业大学 园艺学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

番茄与叶霉菌互作过程中WRKY转录因子的生物信息学和功能分析

王秋颖1，薛东齐2，陈秀玲2，李景富2，王傲雪1,2*

(1.东北农业大学 生命科学学院，黑龙江 哈尔滨 150030； 2.东北农业大学 园艺学院，黑龙江 哈尔滨 150030)

为了明确含Cf-12基因的番茄与叶霉菌非亲和互作过程中WRKY转录因子所扮演的角色，首先对非亲和互作4 d和8 d转录组中WRKY基因的表达量进行比较分析，然后对相关WRKY基因进行系统进化分析和病毒接种的基因沉默验证。结果表明，非亲和互作过程中共富集到22个WRKY基因，其中Solyc07g047960.2在接菌后8 d时的表达量达到近20倍。依据WRKY基因CDS序列的系统进化树以及表达量分析结果，部分WRKY基因的表达量在两时间点差异不大，但Cluster Ⅲ中有7个WRKY基因呈现明显的上调表达趋势。对WRKY(Solyc07g047960.2)基因沉默(接种TRV-WRKY)后的番茄植株接种叶霉菌进行鉴定，结果表明，接菌后该基因的表达量相对于接菌前所有提升，且叶片上的过敏性坏死斑点数量明显低于对照组(接种TRV)。以上结果表明，WRKY(Solyc07g047960.2)基因在含Cf-12基因的番茄与叶霉菌的非亲和互作过程中呈现明显的上调表达趋势，积极地参与到对叶霉菌的抗性反应过程中。

番茄； 叶霉菌； WRKY； 差异表达； 基因沉默； 抗性反应

番茄为世界上重要的食用果蔬，其植株在生长发育过程中时刻受到生物和非生物因素的影响，其中尤以生物因素中病毒和病原真菌的侵染最为严重。番茄应对病原物的侵染主要表现出病原相关因子激发的抗性(pathogen associated molecular pattern triggered immunity，PTI)[1]和效应因子激发的免疫(effector triggered immunity，ETI)[2]。针对番茄与叶霉菌的互作，目前已在智利番茄、秘鲁番茄和多毛番茄等多个野生番茄中发现和克隆出Cf-1、Cf-2、Cf-4、Cf-5、Cf-9、Cf-9DC等多个抗性基因[3]，同时也在叶霉菌中发现了与之对应的效应因子Avr1、Avr2、Avr4、Avr5、Avr9等[4-6]，也证实番茄Cf抗性基因与叶霉菌的Avr效应因子符合“gene-for-gene”假说[7]。在Cf-4、Cf-9介导的下游抗性反应通路中，大量的转录因子(transcription factor，TF)参与其中，调控着靶基因的表达，发挥着重要的作用。根据核心结构域的不同，可将TF分为bHLH、bZIP、MYB、ERF、MADS、Zinc-finger、WRKY等多个不同的家族[8]。WRKY是其中一类重要的TF家族[9]，其N端含有高度保守的WRKYGQK氨基酸序列，并在水稻[10]、拟南芥[11-12]、棉花[13]、烟草[14]、大麦[15]、小麦[16]、豆类[17]等植物中大量存在。WRKY 转录因子通过识别靶基因启动子区的W-box序列，特异性地调控下游基因的表达，并积极参与到植物对病原物的抗性反应中[9]。

目前，对番茄Cf-2、Cf-4、Cf-5、Cf-9基因与叶霉菌非亲和互作过程的研究较为成熟，但对于其他抗叶霉病基因的WRKY等转录因子的研究则刚刚起步。本研究对Cf-12基因与叶霉菌非亲和互作的转录组测序结果中的WRKY数据进行生物信息学分析，以期发现在非亲和互作过程中特异性表达的WRKY基因，同时采用病毒介导的基因沉默方法(virus-induced gene silencing，VIGS)对WRKY基因进行沉默验证，从而对Cf与叶霉菌的非亲和互作认知奠定一定的理论基础。

1 材料和方法

1.1 试验数据来源

用于生物信息学分析的WRKY数据来源于2016年东北农业大学园艺学院番茄课题组测定的Cf-12基因与叶霉菌非亲和互作的转录组测序结果，其NCBI的SRA数据库的RUN注册号为SRR4041970、SRR4041973、SRR4041974、SRR4041975、SRR4042017、SRR4042029、SRR4042030、SRR4042031、SRR4042032。通过iTAK软件在PlantTFDB[18](plant transcription factor database，http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中将被定义在番茄转录因子家族中的WRKY基因进行比对鉴定，并通过ClusterW进行WRKY基因CDS序列的多序列比对，利用MEGA的邻接法(Neighbor-Joining，NJ)通过1 000次校验构建系统发生树。同时根据这些WRKY基因在接种叶霉菌后转录组数据中的4 d和8 d差异表达量，采用HemI (Heatmap Illustrator，version 1.0)软件构建热图，进一步分析WRKY基因在非亲和互作中扮演的角色。

1.2 WRKY基因的VIGS验证

1.2.1 试验材料 含Cf-12基因的CGN7495番茄种子和叶霉菌由东北农业大学园艺学院番茄课题组提供；分别含pTRV2-PDS质粒、pTRV1质粒、pTRV2质粒的农杆菌GV3101由清华大学的刘玉乐教授馈赠；BamHⅠ、XbaⅠ等购于MBI公司，DNA胶回收和纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购于北京康为试剂公司；用于VIGS的引物由Primer Premier 6.0设计，序列为上游5′-GCTCTAGACCCTAGTACCTGGAAAG-3′，下游5′-CGCGGATCCTGTCTGGTCGTCTCGT-3′(下划线为酶切位点)，由华大基因公司合成。

1.2.2 VIGS载体构建 含Cf-12基因的CGN7495番茄材料总RNA提取参照Trizol法，用Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 合成cDNA，利用WRKY(Solyc07g047960.2)特异性引物进行扩增，其反应体系和反应参数见表1和表2。将PCR扩增和纯化得到的WRKY保守序列及pTRV2质粒进行BamHⅠ和XbaⅠ的双酶切反应，反应体系为：PCR回收产物(或pTRV2质粒)3 μg，BamHⅠ(10 U/μL)1 μL，XbaⅠ(10 U/μL)2 μL，10×Buffer 3.5 μL，加ddH2O至35 μL；37 ℃酶切4 h，65 ℃灭活20 min。立即采用DNA Clean-up Kit回收酶切后的pTRV2质粒和目标片段，并用T4 DNA连接酶进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取成功连接并转化的DH5α质粒转化农杆菌GV3101。

表1 PCR反应体系

表2 PCR反应参数

1.2.3 农杆菌侵染 农杆菌GV3101注射侵染参照史艳梅等[19]的方法，其中以pTRV1 & pTRV2(TRV)为阴性对照，pTRV1 & pTRV2-PDS(TRV-PDS)为阳性对照，pTRV1 & pTRV2-WRKY(TRV-WRKY)为试验组。将注射接种后的2～3叶期番茄植株置于16 h/8 h(光/暗)、60%湿度、20～22 ℃下进行正常管理。当阳性对照植株新叶出现光漂白症状时，采用引物(上游5′-CTGAAACGAGACGACCAGACA-3′，下游5′-CGACCACCATTATTATCACCC-3′)对WRKY(Solyc07g047960.2)基因进行荧光定量(qRT-PCR)检测，以测定WRKY(Solyc07g047960.2)基因的沉默效率。

1.2.4 叶霉菌的接种处理和鉴定分级 对于沉默处理的植株，采用喷雾接种法于叶背面接种孢子浓度为1×107个/mL的叶霉菌，接种前保持99%湿度24 h，接种后保持95%湿度，昼/夜温度25 ℃/22 ℃，每天光照时间14 h，以TRV沉默处理后接种叶霉菌的番茄植株为对照。对接种后各基因沉默植株的症状调查和抗感性鉴定采用孟凡娟等[20]的方法。

2 结果与分析

2.1 WRKY基因的差异表达分析

根据Cf-12基因与叶霉菌非亲和互作的转录组测序结果，共显著富集到60个转录因子家族，其中WRKY基因家族含有22个WRKY基因，其表达量见表3，非亲和互作的过程中，表达量最高的Solyc07g047960.2在接菌后8 d表达量达到近20倍，共有8个WRKY基因表达量在3倍以上。根据WRKY基因在4 d和8 d时间点的表达量构建热图(图1)，这22个WRKY基因的表达情况总体呈现出2种趋势，即8 d大于4 d的表达量，以及部分WRKY基因的表达量在两时间点的差异不明显(如Solyc05g007110.2、Solyc07g056280.2、Solyc09g066010.2和Solyc10g084380.1)。对22个WRKY基因的CDS序列构建进化树，结果如图2所示，这22个WRKY基因按照进化关系的远近可以分为3个Cluster，其中上调表达量最大的Solyc07g047960.2基因位于Cluster Ⅲ。从Cluster Ⅲ中能够看到，该类群的8个WRKY基因除Solyc02g072190.2在两时间点的表达量差异不大外，其余7个WRKY基因均呈现8 d的表达量明显高于4 d的上调表达趋势；而ClusterⅠ中的8个WRKY基因，除Solyc05g050340.2、Solyc04g072070.2和Solyc02g093050.2在8 d的表达量明显高于4 d外，其余5个WRKY基因在两时间点的表达量差异不大。说明在Cf-12基因与叶霉菌非亲和互作过程中，这些明显上调表达的WRKY基因可能发挥着重要的作用。

表3 非亲和互作过程中差异表达的WRKY转录因子

2.2 WRKY(Solyc07g047960.2)部分序列的克隆和TRV2载体的构建

以番茄cDNA为模板，用WRKY(Solyc07g047960.2)特异性引物扩增473 bp的cDNA片段，PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。对扩增得到的片段进行切胶回收，并送至华大基因公司测序，比对结果显示，其为WRKY(Solyc07g047960.2)基因的特异性片段。将切胶回收产物以及pTRV2质粒进行BamH Ⅰ、XbaⅠ双酶切和纯化回收，经T4 DNA连接酶连接后转化DH5α，将菌液PCR和质粒酶切检测均正确的重组质粒命名为pTRV2-WRKY，并转化农杆菌GV3101，用于VIGS验证试验，其中pTRV2-WRKY质粒的BamHⅠ、XbaⅠ双酶切电泳结果见图3。

图1 22个WRKY基因热图

图2 22个WRKY基因CDS序列的进化树

M．Marker；1.PCR产物；2.酶切产物

2.3 WRKY(Solyc07g047960.2)基因的VIGS沉默效率

当阳性对照(TRV-PDS)植株新生叶片出现明显的白化症状时，对部分pTRV1 & pTRV2-WRKY处理植株进行总RNA提取，并反转录为cDNA，通过qRT-PCR方法检测WRKY(Solyc07g047960.2)基因的VIGS沉默效率，如图4所示，TRV-WRKY(1)和TRV-WRKY(2)的沉默效率分别为94.69%和88.49%，说明本试验所构建的WRKY沉默载体获得了较好的沉默效果。

图4 WRKY(Solyc07g047960.2)基因沉默的qRT-PCR分析

2.4 VIGS植株的症状观察和叶霉菌接种鉴定

试验中，将TRV-PDS沉默处理的番茄植株作为阳性对照，待阳性对照植株新生叶片出现明显的白化症状时，表明VIGS体系已经有效建立，WRKY(Solyc07g047960.2)基因沉默植株的症状如图5所示，在形态上与阴性对照(TRV)植株并无明显的区别。对试验组(TRV-WRKY)和对照组(TRV)分别喷施叶霉菌孢子悬液，15 d后植株的发病情况如图6所示，WRKY(Solyc07g047960.2)沉默植株接种叶霉菌后的基因表达量测定结果如图7所示，与图4中接菌前的基因表达量相比，接菌后WRKY(Solyc07g047960.2)基因的表达量有所提高，2个沉默植株分别达到对照的35%和40%，呈现在植株上的症状是，部分WRKY(Solyc07g047960.2)沉默植株丧失了对叶霉菌的抗性，但仍有一定的过敏性坏死症状产生(图6)，这可能是由于VIGS的基因沉默效率并不能达到100%的缘故，纵使是低表达的WRKY(Solyc07g047960.2)也能够使植株维持一定的抗病性，但其抗病性却远低于对照组，也说明该WRKY基因在番茄抵御叶霉菌侵染过程中发挥着重要作用。

图5 VIGS番茄植株的症状观察

图6 WRKY(Solyc07g047960.2)沉默番茄植株的叶霉病抗性

图7 接菌后WRKY(Solyc07g047960.2)基因的qRT-PCR测定

3 结论与讨论

随着植物对病原菌抗性机制研究的深入，转录因子的研究逐渐成为植物基因功能研究的重点之一。WRKY转录因子能够参与多种生物和非生物胁迫反应过程，能够调控植物的生长发育等一系列生理生化过程。WRKY 转录因子家族成员的数量在不同物种间存在着较大的差异，在植物中分布较广。拟南芥的WRKY转录因子家族有72个成员，水稻中有96个成员，而在黄瓜中有55个WRKY基因[12，21-22]。本研究中，在番茄与叶霉菌发生非亲和互作时，有22个WRKY基因被显著富集到。对这22个WRKY基因的CDS序列进行进化分析显示，其可分为3个类群，在Cluster Ⅲ中的8个WRKY基因除Solyc02g072190.2在两时间点的表达量差异不大外，其余7个WRKY基因均呈现8 d的表达量明显高于4 d的上调表达趋势；在其他2个类群的14个WRKY基因，大部分的表达量上调并不是很显著，但由于WRKY转录因子也积极调控植物的损伤、衰老、发育及代谢等生物过程，因此它们可能在番茄与叶霉菌的非亲和互作过程中也发挥着一定的作用，这有待进一步研究。

对于WRKY基因Solyc07g047960.2的功能分析，本研究采用的是VIGS方法，该方法较常规的转基因方法具有省时省力和效率高的特点，能够快速对基因功能进行初步鉴定。试验中以PDS基因为阳性对照，能够明显地指示基因沉默的发生过程，对Solyc07g047960.2基因在番茄中进行沉默处理后可以看到，沉默效率在88.49%～94.69%，不能达到100%，可能是由于所采用的番茄植株苗龄较大造成的[23]。用叶霉菌孢子喷施处理后15 d检测发现，WRKY(Solyc07g047960.2)基因的表达量达到对照的35%～40%，说明该基因的VIGS沉默植株在叶霉菌喷施处理后表达量有了一定程度的上升。但也能够观察到部分WRKY(Solyc07g047960.2)沉默番茄植株叶片上出现过敏性坏死斑点，且叶片的坏死斑点数量明显低于对照，说明该WRKY基因在番茄对叶霉菌的抗性过程中发挥着一定作用。结合转录组测序的结果可知，WRKY(Solyc07g047960.2)基因在含Cf-12基因的番茄与叶霉菌的非亲和互作过程中呈现显著的上调表达趋势，其积极地参与到对叶霉菌的抗性反应过程中。

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Bioinformatics and Functional Analysis of WRKY Transcription Factors in Interaction between Tomato and Cladosporium fulvum

WANG Qiuying1，XUE Dongqi2，CHEN Xiuling2，LI Jingfu2，WANG Aoxue1,2*

(1.College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China；2.College of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin 150030，China)

To preliminarily define the role of WRKY transcription factors in the incompatible interaction betweenCf-12 tomato andCladosporiumfulvum,we analyzed differential expression of WRKY transcription factors in the transcriptome of 4 d and 8 d time points of incompatible interaction,and then conducted phylogenetic analyses and gene silencing by virus inoculation.The results showed that 22 WRKY genes were enriched in the process of incompatible interaction,and the expression ofSolyc07g047960.2 at 8 days post inoculation increased by nearly 20 times.According to phylogenetic analysis and expression analysis of WRKY CDS,the expression of some WRKY genes was not significantly different at two time points,however,in Cluster Ⅲ,7 WRKY genes showed significant up-regulated expression.After identification ofWRKYgene silenced tomato plants(inoculated by TRV-WRKY),the results ofCladosporiumfulvuminoculation showed that the expression ofWRKYgene was increased compared with that before inoculation,and the number of hypersensitive necrotic spots on leaf was obviously lower than the control(inoculated by TRV).The conclusion was that theWRKY(Solyc07g047960.2) gene showed a significantly up-regulated expression during the incompatible interaction betweenCf-12 tomato andCladosporiumfulvum,and was actively involved in the resistance response to the tomato leaf mold disease.

tomato;Cladosporiumfulvum; WRKY; differential expression; gene silencing; resistance response

S436.412.1

A

1004-3268(2017)11-0074-06

2017-04-19

黑龙江省杰出青年基金项目(JC2015004)

王秋颖(1986-)，女，黑龙江哈尔滨人，在读博士研究生，研究方向：番茄抗病、抗逆机理。

E-mail:wangqiuying1986@163.com

*

王傲雪(1973-)，男，黑龙江哈尔滨人，教授，主要从事番茄抗病、抗逆机理研究。E-mail：axwang@neau.edu.cn