孟 玮，杨天燕，阿地力，咸玉兰

( 新疆维吾尔自治区水产科学研究所，新疆 乌鲁木齐 830000 )

基于ITS1基因分析亚东鲑(♂)、虹鳟(♀)及其F1代遗传关系

孟 玮，杨天燕，阿地力，咸玉兰

( 新疆维吾尔自治区水产科学研究所，新疆 乌鲁木齐 830000 )

虹鳟、棕鳟均为优质水产养殖品种，亚东鲑为棕鳟的同物异名，是19世纪西藏由欧洲引进。为探索杂种优势，对亚东鲑和虹鳟进行杂交试验，对其子一代幼鱼与虹鳟、棕鳟进行了体长和体质量测定。采用ITS1基因分析其遗传关系，并与巴基斯坦引进的棕鳟对比研究。结果发现F1代体长、体质量增长快于虹鳟、棕鳟，其遗传多样性高于亚东鲑和虹鳟，略低于棕鳟，表明F1代具有一定杂种优势。此外，棕鳟较高的遗传多样性也反映出从巴基斯坦引进的发眼卵遗传背景较好，具有进一步养殖选育的潜力。

ITS1；基因；亚东鲑；棕鳟；虹鳟；杂种优势

虹鳟(Oncorhynchusmykiss)，属鲑形目、鲑科，原产美国西海岸，1959年引进我国。因性成熟个体体侧沿侧线中部有一条宽而鲜艳的紫红色彩虹带而得名。虹鳟具有生长周期短、成本低、肉质好等特点，是世界上广泛养殖的重要冷水性鱼类。虹鳟营养成分高于“四大家鱼”[1]，也是世界粮农组织推荐养殖的三大鱼类之一。棕鳟(Salmotruttafario)又名河鳟，是原产欧洲、北非和西亚的一种名贵冷水性鲑科鱼类[2]。十八世纪初英国人将其引入印度和巴基斯坦地区，经过几个世纪的繁衍生息，已在当地形成一定规模和数量的自然种群。棕鳟因生长迅速、个体大、色彩艳丽、肉质鲜美、营养价值高，极具经济价值和市场发展潜力，目前已被引入到30多个国家和地区。亚东鲑为棕鳟的同物异名，19世纪英国人自欧洲引种至西藏地区亚东河，始称亚东鲑，1992年被列为西藏自治区二级保护水生动物。

杂交育种是水产养殖中应用广泛的一种传统育种技术。根据亲缘关系的远近可以分为近缘杂交和远缘杂交。近缘杂交一般指种内杂交，远缘杂交则包括种间、属间、亚科间、科间杂交。杂交育种利用分离、自由组合和连锁互换规律，可以产生杂种优势，培育出具有优良性状的新品种。例如，金鳟是从虹鳟突变种选育出来的金黄色品系，但纯系的金鳟抗病力较低，而与虹鳟杂交后子一代体质得到改良，从稚鱼至成鱼较其亲本表现出摄食力强、耐高密度饲养的优势[3]。

为进一步开发杂交品种，需要明确子一代遗传背景。随着分子标记技术的成熟，采用这些工具进行亲缘分析得到广泛开展。张玉勇等[4]采用微卫星标记分析了虹鳟、山女鳟(O.masou)及其子代的遗传关系；隋班良等[5]采用AFLP标记分析了黄姑鱼(Nibeaalbiflora)与大黄鱼(Pseudosciaenacrocea)杂交F1代的遗传组成。此外，ISSR、RAPD、SRAP等标记也在杂交种分析中得到应用。与上述标记相比，直接基因测序分析具有更高的准确性。然而，目前国内采用基因片段进行子代遗传分析的报道较少，线粒体标记尽管在鱼类中应用较多，但由于其母系遗传特性不适用于亲本与子代关系分析。ITS基因作为核基因不受母系遗传限制，进化速率适合进行种间杂交的遗传背景分析[6]。本研究采用ITS1标记分析了虹鳟、亚东鲑及其子一代的遗传关系，同时选取了来自巴基斯坦的棕鳟作为对比，以期探明其遗传关系。

1 材料与方法

1.1 样本来源及形态测定

本研究用样本均采自乌鲁木齐市达坂城区东沟冷水鱼养殖试验场，其中亚东鲑为2008年西藏亚东引进，棕鳟为2011年巴基斯坦引进，亚东鲑(♂)与虹鳟(♀)杂交子代为2009年人工繁殖。现场剪取新鲜尾鳍组织用无水乙醇浸泡固定，带回实验室后置于冰箱-20 ℃保存。对棕鳟、虹鳟及杂交F1代个体幼苗进行形态测量，测量时间为8月龄、10月龄及2.5龄。分别测量3种幼鱼50尾的体长及体质量。分别用Y代表亚东鲑，Z代表棕鳟，H代表虹鳟，F代表亚东鲑(♂)、虹鳟(♀)的杂交子代。

1.2 基因组DNA抽提、PCR扩增及克隆

试验前将鳍条充分漂洗、晾干并剪碎，采用标准酚—氯仿法提取基因组[7]。扩增引物序列为Gits1F(5′-AAAAAGCTTCCGTAGGTGAACCTGCG-3′)和Gits1R(5′-AGCTTGCTGCGTTCTTCATCGA-3′)[7]。

PCR反应总体积50 μL，其中10×buffer 5.0 μL，Mg2+终浓度为2.0 mmol/L，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，Taq聚合酶2 U，引物(10 μmol/L)各2 μL，模板DNA 2 μL(1 μg)，加灭菌水至终体积50 μL。反应条件为：95 ℃预变性5 min，然后是35个循环，每个循环包括94 ℃变性45 s、55 ℃退火45 s、72 ℃延伸1 min，最后72 ℃再延伸10 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，使用天根回收试剂盒纯化回收后与pMD18-T载体连接，转化至大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α。每个种选取10个个体，每个个体挑取1个单克隆进行测序。

1.3 数据分析

采用DNASTAR Lasergene 7.1.0软件对同源序列进行比对、编辑和校准；Dnasp 5.10.1[9]软件计算变异位点、单倍型数、单倍型多样性指数、核苷酸多样性指数等；Mega 6.0[10]软件基于Kimura双因子参数模型构建邻接系统进化树，1000次重抽样检验系统树中节点的自引导值。

2 结 果

获得的ITS1序列T、C、A、G含量分别为20.3%、31.8%、17.5%、30.5%，A+T含量小于G+C含量。比较序列长度在614～619 bp，其中虹鳟长度为614～615 bp，亚东鲑为617～618 bp，棕鳟为617～619 bp，F1代中2个单倍型为617 bp，其余5个均为614～615 bp。

分别计算虹鳟、棕鳟、亚东鲑、杂交F1代的遗传多样性参数(表1)，棕鳟9尾个体中发现7种单倍型，其单倍型多样度和核苷酸多样度均为最高；虹鳟10尾个体中发现2种单倍型，其单倍型多样度和核苷酸多样度均为最低。亚东鲑多样性略低于棕鳟，高于虹鳟。杂交子代多样性高于亚东鲑和虹鳟，略低于棕鳟。

图1 基于ITS1基因序列构建的邻接系统树Y，亚东鲑；Z，棕鳟；H，虹鳟；F，亚东鲑(♂)、虹鳟(♀)的杂交子代.

从构建的系统发育树来看，主要分成了两支(图1)。一支包含了棕鳟、亚东鲑与2尾F1代个体(2个单倍型，称为F1代Z型)。另一支包含了虹鳟与7尾F1代个体(5个单倍型，称为F1代H型)。从两支的单倍型来看，棕鳟一支有1个主体单倍型，包含3尾亚东鲑，2尾棕鳟，1尾F1代。虹鳟一支有2个主体单倍型，一个包含5尾虹鳟与3尾F1代，一个包含5尾虹鳟与2尾F1代。这3个主体单倍型以外的单倍型均不超过2尾个体。

Mega软件计算群体间遗传距离(表2)，结果显示最小遗传距离出现在虹鳟与F1代H型之间，最大遗传距离分别出现在F1代H型与Z型、F1代Z型与虹鳟间。亚东鲑和棕鳟的遗传距离小于1%，仍在种的范围内。虹鳟与亚东鲑、棕鳟的遗传距离分别为13.5%、13.6%。

分别对棕鳟、虹鳟及杂交种的苗种生长发育情况进行比较发现，不论体长还是体质量，杂交种生长速度最快，是虹鳟与棕鳟生长速度的2～3倍(表3)。

表1 4个群体鱼类遗传多样性参数

表2 5个群体鱼类遗传距离

表3 3个群体鱼类生长性状比较

3 讨 论

亚东鲑为国外引入西藏品种，现存亚东鲑多是当时引进的少量亲本的后代，受到奠基者效应的影响，其遗传多样性有一定的降低。豪富华[11]采用线粒体Cyt b和D-loop基因分析了西藏亚东河流的亚东鲑和丹麦引进棕鳟群体间遗传差异，经比较发现二者两个基因序列完全相同。此外，笔者也曾采用线粒体COⅠ基因检测了同一批次亚东鲑样品遗传变异情况，结果所有个体均为同一种单倍型。上述研究均揭示了亚东鲑较低的遗传多样性现状。然而，从本研究分析的核糖体DNA转录间隔区ITS1基因来看，其遗传多样性较线粒体基因更丰富，表明亚东鲑核基因ITS1的变异程度高于线粒体基因。本研究中棕鳟为巴基斯坦引进发眼卵孵化培育所得个体，由于巴基斯坦的棕鳟引种时间早于亚东鲑一个世纪，受基因突变的影响，其遗传多样性尤其是核苷酸多样性高于亚东鲑。此外，棕鳟较高的遗传多样性反映出这些发眼卵遗传背景较好，具有进一步养殖选育的潜力。

淡水鱼类杂交现象普遍存在。Hubbs[12]认为杂交现象在引种地或者物种生境遭到物理或生物干扰的地方会较高。鲑鳟鱼类作为一种引种广泛的鱼类，杂交现象在鲑亚科已有广泛报道，如鲑属的大西洋鲑(S.salar)与棕鳟[13-14]，大麻哈鱼属的切喉鳟(O.clarkiilewisi)与虹鳟[15-16]，红点鲑属(Salvelinus)的美洲红点鲑(S.fontinalis)与白斑红点鲑(S.leucomaenis)[17]。尽管杂种优势经常被用来选育新品种，但是并非所有的杂交都能给后代带来优势，如切喉鳟和虹鳟的杂交后代生长和存活性能较亲本大幅度降低[18]。虹鳟和亚东鲑杂交试验国内尚未见相关报道，本研究中二者杂交子代遗传多样性高于父、母本，从生长性能来看，F1代在3个时间段体长和体质量也都明显优于亲本。综合上述研究结果表明，二者的杂交种具有杂种优势，有进一步开发的潜力。

远缘杂交一般指在分类学上物种以上分类阶元个体之间的交配。由于亲本亲缘关系较远，杂交时精卵结合的情况比较复杂。有些时候仅仅部分遗传物质发生合并或交换，有些时候未发生精卵结合即雄核或雌核发育。本研究中虹鳟与亚东鲑杂交是属间的远缘杂交。从F1代的遗传属性看，它并非完全偏向亲本的一方，而是分成了两种类型，暗示二者杂交时应该存在遗传物质的交流，不属于精卵不结合的情况。ITS1基因并没有明显的单亲遗传现象，与母系遗传的线粒体基因相比更适合进行亲子关系分析。

ITS基因已经在植物杂交种鉴定中得到广泛应用，本研究中ITS基因能够有效区分两亲本，通过对F1代与亲本单倍型的比较，证明了F1代确为两亲本的杂交种。尽管F1代数据显示其遗传性状偏向母本虹鳟，但这可能是由于仅仅挑取1个单克隆所致。聚类分析显示父、母本ITS1单倍型分别聚在一起没有交叉，故F1代个体的ITS1基因可能存在分别偏向父、母本两种类型。本研究在F1代中未检测到两种亲本基因型的交换重组序列。

种间杂交亲和性与物种遗传距离有一定关系。徐冬冬等[19]对8种鲆鲽鱼类研究发现，遗传距离小于0.04，正反交后代均可以存活；遗传距离为0.04～0.15，正反交单向后代可以存活；种间距离大于0.15，则杂交后代很难存活。本研究中虹鳟与亚东鲑的遗传距离相对较大(0.135)，但是杂交种仍可以存活，由于缺乏反交验证，尚难以判断是否为单向存活。本研究中的杂交种表现出了一定的杂种优势，但值得注意的是，杂交种自交会产生基因分离，不能保持杂种优势，与其他鱼杂交会产生遗传污染。因此，对杂交种尤其是具有繁育能力的杂交种应严格控制其在自然环境中的扩散。

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GeneticAnalysisofYadongSalmon(♂),RainbowTrout(♀)andTheirF1HybridBasedonITS1Gene

MENG Wei, YANG Tianyan, A Dili, XIAN Yulan

( Xinjiang Fisheries Research Institute, Urumqi 830000, China )

Rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) and brown trout (Salmontrutta) are high-quality aquaculture species, and Yadong salmon is synonym of brown trout introduced from Europe to Tibet in 19th century. To explore the heterosis of salmo fishes, a hybrid experiment between Yadong samlo and rainbow trout was carried out, and the body length and body weight of F1hybrid, rainbow trout and brown trout were measured. Their genetic relationship was analyzed by ITS1 gene, and compared with brown trout introduced from Pakistan. The results showed that F1had more rapid growth rate than rainbow trout and brown trout did, higher genetic diversity than Yadong Salmon and rainbow trout, and slightly lower than brown trout, indicating the heterosis of F1generation. High genetic diversity of brown trout reflects the good genetic background, and shows the potential for further breeding.

ITS1 gene;Yadong salmon; brown trout; rainbow trout; heterosis

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.020

S965.232

A

1003-1111(2017)03-0373-04

2016-05-11；

2016-09-06.

新疆少数民族科技人才特殊培养计划科研项目(201423129).

孟玮(1982-)，男，高级工程师；研究方向：渔业种质资源. E-mail：mengwei1982@hotmail.com.通讯作者： 杨天燕(1982-)，女，高级工程师；研究方向：鱼类种群遗传学. E-mail：hellojelly1130@163.com.