陈 仲，杨爱馥，王 摆，蒋经伟，高 杉，董 颖，周遵春

( 辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室，辽宁 大连 116023 )

仿刺参纤维胶凝蛋白基因的分子特征及表达分析

陈 仲，杨爱馥，王 摆，蒋经伟，高 杉，董 颖，周遵春

( 辽宁省海洋水产科学研究院,辽宁省海洋水产分子生物学重点实验室，辽宁 大连 116023 )

纤维胶凝蛋白是非特异性免疫系统中的重要分子。通过转录组测序及cDNA末端快速克隆技术得到一条仿刺参纤维胶凝蛋白基因的全长cDNA序列，并将其编码的蛋白命名为仿刺参纤维胶凝蛋白-1。获得的基因cDNA全长为1951 bp，其中5′-末端非翻译区为397 bp，3′-末端非翻译区为666 bp，开放阅读框为888 bp，编码295个氨基酸，N端16个氨基酸为信号肽，信号肽后面有两个G-X-Y重复序列，C端为纤维蛋白素原结构域。采用实时荧光定量PCR方法分析了仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参幼参不同组织及细菌脂多糖刺激后的时序表达规律，结果显示仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参的肠道、呼吸树、体腔细胞和体壁均有表达，且肠道的表达量最高；脂多糖刺激后，4种组织的仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因表达量均有变化，且以肠道和体壁表达量的变化最为显著；此外，仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参4种组织中的表达量变化具有不同的时序性，表明仿刺参纤维胶凝蛋白-1可能在仿刺参免疫应答中起重要作用。

仿刺参；纤维胶凝蛋白；序列分析；基因表达；脂多糖刺激

纤维胶凝蛋白(ficolin)是一组存在于多种动物体内，组织分布广泛的寡聚蛋白，在非特异性免疫中发挥重要作用[1]。纤维胶凝蛋白最初是作为一种转化生长β因子结合蛋白发现于猪子宫内膜细胞上[2]，目前已经发现多种重要的纤维胶凝蛋白家族成员，证实是机体天然免疫中的关键分子[3]。纤维胶凝蛋白由胶原样结构域和纤维蛋白素原结构域组成[1]，可以通过凝集素途径激活补体系统，继而形成C3转化酶，形成攻膜复合体使细菌溶解，或者提高吞噬细胞对细菌的吞噬作用[4-5]。目前已有报道，纤维胶凝蛋白广泛存在于两栖动物[6]、爬行动物[7]、哺乳动物[8-9]等脊椎动物体内，近年来信号小龙虾(Pacifastacusleniusculus)[10]、真海鞘(Halocynthiaroretzi)[11]、近江牡蛎(Crassostreahongkongensis)[12]、文昌鱼(Branchiostomafloridae)[13]、紫海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)等无脊椎动物和脊索动物体内也陆续证明了纤维胶凝蛋白的存在，仿刺参纤维胶凝蛋白基因的克隆及表达规律的研究尚未见报道。

仿刺参(Apostichopusjaponicus)属棘皮动物门、海参纲。棘皮动物处于由无脊椎动物向脊椎动物开始分支进化的阶段，所以棘皮动物是研究免疫系统进化的宝贵材料。仿刺参是我国北方重要的海产经济物种，但其养殖受到细菌性病害的严重影响，因此，研究仿刺参免疫的分子机制具有重要的现实意义。笔者通过仿刺参转录组测序得到了一条与其他物种纤维胶凝蛋白同源性较高的cDNA序列[14]，通过cDNA末端快速克隆技术得到该基因的全长cDNA序列，将其编码的蛋白命名为仿刺参纤维胶凝蛋白-1，对其基因及蛋白结构特征进行了分析，并分析了其在仿刺参不同组织及脂多糖刺激前后的表达规律，为深入研究仿刺参免疫分子机制提供了依据。

1 材料与方法

1.1 材料

仿刺参幼参来源于大连广鹿岛海域，规格为(10.0±0.5) g。鲜活样品取回后于人工育苗池常规条件下暂养一周，暂养期间保持充气。所用海水均经过砂滤，水温16～18 ℃，盐度32，pH 7.8～8.2。

1.2 试验方法

1.2.1 仿刺参纤维胶凝蛋白-1全长基因序列的扩增

通过转录组测序得到了一条与其他物种纤维胶凝蛋白同源性较高的cDNA序列[14]，使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit与Advantage 2 PCR Enzyme System 试剂盒(Clontech)进行5′和3′ 末端扩增，利用Primer Premier 6.0设计特异引物 5r-1和3r-1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物序列见表1，通用引物UPM和巢式引物NUP为试剂盒中自带引物。使用特异引物和UPM进行第1轮PCR，反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 10 min。以第1轮PCR产物稀释100倍作为模板，用特异引物和NUP进行巢式PCR，条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，68 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 10 min。

扩增产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳分离检测，利用 Agarose GEL DNA Fragment Recovery Kit Ver. 2.0(TaKaRa)回收目的片段，连入克隆载体 pMD19-T，转化到感受态细胞大肠杆菌(Escherichiacoli)JM109，所获得的阳性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司进行序列测定。测序结果与原序列进行拼接，获得仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因的cDNA 全长。

1.2.2 蛋白序列特征分析及分子进化分析

将仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因的cDNA和蛋白序列与 GenBank 核酸数据库及蛋白数据库做BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对分析。应用 ORF Finder 程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)确定正确的开放阅读框并推导其编码的氨基酸序列。用Simple Modular Architecture Reach Tool(SMART，http://smart.embl-heidelberg.de/)进行信号肽和蛋白结构域预测。使用Clustal X 2.0软件进行多重序列比对[15]，采用MEGA 4.0的邻接法构建系统进化树，重复抽样次数设为1000来计算各分支的置信程度。

1.2.3 脂多糖刺激

健康仿刺参幼参(约10 g)饲养于水族箱内，2 d内不投喂任何饵料，排空消化道内食物，注射脂多糖500 μL(1 μg/μL)，对照组注射500 μL无菌海水，空白组(0 h)无任何注射。幼参注射脂多糖4、12、24、48、72 h后用饱和MgSO4麻醉，无菌海水冲洗后取肠道、呼吸树、体腔细胞和体壁，各种组织分别取10个个体的混合样，重复3次，投入液氮中迅速冷冻，-80 ℃保存备用。

1.2.4 总RNA提取

用RNAprep pure 动物组织总RNA提取试剂盒(TIANGEN)提取仿刺参不同组织的总RNA，电泳检测RNA的完整性，用Implen Nanophotometer核酸蛋白分析仪(德国) 检测RNA的纯度和浓度。

1.2.5 实时荧光定量PCR

取每个样品的总RNA 900 ng用Prime-ScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa)进行反转录，反应体积及反应条件按照说明书进行。

实时荧光定量PCR采用SYBR Green Ⅰ染料法(SYBR PrimeScriptTMRT-PCR Kit，TaKaRa)，在Mx 3000pTM荧光定量PCR仪(Stratagene，La Jolla，CA，USA)上进行。以Cytb基因作为内参[16]，仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因和内参基因的引物序列见表1。反应终体积20 μL：2×SYBR Green Master mix缓冲液10 μL，ROX Reference DyeⅡ 0.4 μL，cDNA样品1 μL，引物各0.4 μmol/L。反应条件：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，56 ℃退火25 s，72 ℃延伸25 s，40个循环，每个样品设3个重复。

表1 PCR所用引物序列

1.2.6 数据分析

相对表达水平通过 Relative Expression Software Tool 384 v.2软件计算[17]。运用单因素方差分析和多次对比检验分析比较试验组和对照组表达水平的差异性，P<0.05视为差异显著。

2 结果与分析

2.1 仿刺参纤维胶凝蛋白-1序列分析

仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因cDNA序列全长为1951 bp，其中5′-末端非翻译区为397 bp，3′-末端非翻译区为666 bp，开放阅读框为888 bp，编码295个氨基酸，分子量为33.4 ku，理论等电点为4.62。利用SMART对仿刺参纤维胶凝蛋白-1结构进行分析，该蛋白N端16个氨基酸为信号肽，信号肽后面有2个G-X-Y重复序列，其中G为甘氨酸，X、Y为任意氨基酸。C端的纤维蛋白素原结构域位于79～290氨基酸之间(图1)。

图1 仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因cDNA及氨基酸序列分析仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因cDNA及其氨基酸序列，大写字母和小写字母分别表示开放阅读框和非翻译区；下划线标注为信号肽；G-X-Y重复序列用双下划线标注；阴影标注为纤维蛋白素原结构域；方框标注为Ca2+结合位点；多聚腺苷酸信号(AATAAA)用黑体加斜体标注；poly A尾用黑体标注.

2.2 仿刺参纤维胶凝蛋白-1氨基酸序列的同源性分析

将仿刺参纤维胶凝蛋白-1的氨基酸序列输入到NCBI蛋白数据库中进行BLASTP比对，发现仿刺参纤维胶凝蛋白-1的氨基酸序列与鸭嘴海豆芽(Lingulaanatina)的ficolin-1序列相似度最高，为50%，其次是同为棘皮动物的紫海胆(Strongylocentrotuspurpuratus)ficolin-1，序列相似度为48%。在NCBI数据库中搜索纤维胶凝蛋白，选取不同进化地位的代表生物用于序列比对和进化分析，所选物种及NCBI登记号见表2。对不同物种纤维胶凝蛋白的纤维蛋白素原结构域进行序列比对，结果显示包括仿刺参纤维胶凝蛋白-1在内的各物种纤维胶凝蛋白的纤维蛋白素原结构域中均包含4个保守的半胱氨酸残基和一个Ca2+结合位点，除毛首鞭虫(Trichuristrichiura)以外，其他物种的Ca2+结合位点序列均为D-N-D(图2)。

以表2中不同物种纤维胶凝蛋白氨基酸序列构建邻接系统进化树，基本符合物种的传统分类进化关系，仿刺参处于低等无脊椎动物和脊索动物之间，与海胆亲缘关系最近，这与诸多研究结果一致[18-20](图3)。

表2 不同物种纤维胶凝蛋白的NCBI登记号

图2 仿刺参纤维胶凝蛋白-1纤维蛋白素原结构域氨基酸序列与其他物种的同源性比对黑色背景代表保守区，灰色背景代表高度保守区；▼表示保守的半胱氨酸残基；＊表示Ca2+结合位点.

图3 纤维胶凝蛋白的邻接系统进化树

2.3 仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因的组织表达

利用实时荧光定量PCR方法检测仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在不同组织中的表达情况。仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在的肠道、呼吸树、体腔细胞和体壁4种组织中均有表达，体腔细胞中的表达量最低，其他3种组织中的表达量均明显高于体腔细胞。肠中的表达量最高，为体腔细胞中的7.5倍，其次为体壁，表达量为体腔细胞中的5.5倍(图4)。

图4 仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因的组织表达分析＊表示该组织仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因表达量与体腔细胞存在显著差异.

2.4 脂多糖刺激后仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参不同组织中的时序表达

利用实时荧光定量PCR方法研究了脂多糖刺激后仿刺参肠道、呼吸树、体腔细胞和体壁4种组织中仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因的时序表达情况，结果显示仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在脂多糖刺激后4种组织中的表达规律存在差别(图5)。首先在肠道中，仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因的表达显著正调控，刺激组表达量在12 h即达到对照组的10倍，24 h达到了顶峰，为对照组的27倍，48 h开始下降，但仍显著高于对照组，整体显现出先升后降的趋势。而在体壁中，仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因表达显著负调控，刺激组表达量在48 h达到最低点，仅为对照组的0.1倍。在体腔细胞中，脂多糖刺激后4 h，刺激组的表达量相对于对照组即有一个显著的升高，随后开始下降，24 h和48 h刺激组的表达量明显低于对照组，72 h刺激组的表达量再一次升高，达到对照组的2.5倍。在呼吸树中，刺激组的表达量相对于对照组呈现出先升后降的趋势，但与肠道不同的是，呼吸树中刺激组的表达量仅在24 h显著高于对照组(2.2倍)，其他时间点均显著低于对照组。

图5 脂多糖刺激后仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参不同组织中的时序表达a. 体腔细胞；b. 体壁；c. 呼吸树；d. 肠道.＊表示某时间点刺激组与对照组存在显著差异.

3 讨 论

纤维胶凝蛋白是在非特异性免疫中起到重要作用的蛋白因子[1]，纤维蛋白素原结构域是纤维胶凝蛋白识别并结合细菌表面糖基的结构域，与纤维胶凝蛋白结合的糖类配体都是病原微生物表面常见的结构成分，人L-ficolin可以识别伤寒杆菌(Salmonellatyphimurium)表面的糖结构，并能识别和结合革兰氏阳性细菌如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、链球菌(Streptococcusagalactiae)的细胞壁成份磷壁酸[21-22]；H-ficolin能结合伤寒杆菌和明尼苏达沙门氏菌(Salmonellaminnesota)的脂多糖[23]；仿刺参纤维胶凝蛋白-1的C端有一个纤维蛋白素原结构域，与其他物种该结构域比对结果显示，仿刺参纤维胶凝蛋白-1具有保守的半胱氨酸残基和Ca2+结合位点，推测仿刺参纤维胶凝蛋白-1可以像脊椎动物一样行使识别并结合病原菌糖基的功能。在其他无脊椎动物中，信号小龙虾纤维胶凝蛋白可凝集大肠杆菌、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)和金黄色葡萄球菌，并可以帮助机体清除注入血淋巴中的革兰氏阴性菌[10]；近江牡蛎的重组纤维胶凝蛋白可在体外凝集大肠杆菌并增强对其吞噬作用[12]。在脊索动物海鞘体内，纤维胶凝蛋白可识别并结合含N-乙酰氨基的多种糖类[11]。

脊椎动物纤维胶凝蛋白由胶原样结构域和纤维蛋白素原结构域两部分结构域组成，例如非洲爪蟾[6]、玉米锦蛇[7]、人[9]等，纤维胶凝蛋白与病原菌表面糖基结合后，通过胶原样结构域结合甘露聚糖结合凝集素相关的丝氨酸蛋白酶，进一步通过凝集素途径激活补体系统[4-5]。而牡蛎[12]、文昌鱼[13]等无脊椎动物和脊索动物的纤维胶凝蛋白只有纤维蛋白素原结构域而不具有胶原样结构域。仿刺参纤维胶凝蛋白-1 N端有2个G-X-Y重复序列，而脊椎动物纤维胶凝蛋白的胶原样结构域是由多个G-X-Y重复序列组成，仿刺参纤维胶凝蛋白-1 N端的2个G-X-Y重复序列能否同胶原样结构域行使相同的功能有待于进一步研究。

棘皮动物的先天免疫功能主要是由体腔液中的体腔细胞和免疫分子来完成，本试验结果表明，在正常生长状态下的仿刺参，其各种组织中均存在纤维胶凝蛋白-1基因的表达，肠道和体壁的表达量高于呼吸树和体腔细胞。而在脂多糖刺激后，肠道和体壁中纤维胶凝蛋白-1的免疫应答较其他组织表现得更为活跃，原因可能是由于仿刺参摄食的食物内含有大量的病原菌，而肠道组织直接与这些病原菌接触；而体壁与海洋环境中的病原菌直接接触，肠道组织和体壁是海参抵御外来病原的第一道防线，因而有免疫相关基因的高水平表达。经脂多糖刺激后，仿刺参4种组织的纤维胶凝蛋白-1基因表达量均发生显著变化，且存在不同的时序性，说明在4种组织中，仿刺参纤维胶凝蛋白-1均参与了仿刺参对病原菌的免疫应答过程。在其他海洋无脊椎动物中，牡蛎的血淋巴内纤维胶凝蛋白基因表达量在鳗弧菌(Vibrioanguillarum)和溶血性葡萄球菌(S.haemolyticus)感染后均有显著的升高，并呈现出先升后降的趋势[12]，这说明其他海洋无脊椎动物与仿刺参相似，纤维胶凝蛋白均在机体对病原菌的免疫应答过程中起到重要作用。

[1] Ichijo H，Hellman U，Wernstedt C，et al. Molecular cloning and characterization of ficolin, a multimeric protein with fibrinogen- and collagen-like domains[J]. J Biol Chem，1993，268(19)：14505-14513.

[2] Ichijo H，Rönnstrand L，Miyagawa K，et al. Purification of transforming growth factor-beta 1 binding proteins from porcine uterus membranes[J]. J Biol Chem，1991，266(33)：22459-22464.

[3] 乔滨，熊思东. 糖类模式识别分子纤维胶凝蛋白与补体凝集素活化途径[J]. 生命的化学，2003，23(5)：358-360.

[4] Matsushita M，Endo Y，Fujita T. Cutting edge:complement-activating complex of ficolin and mannose-binding lectin-associated serine protease[J]. J Immunol，2000，164(5)：2281-2284.

[5] Matsushita M，Endo Y，Hamasaki N，et al. Activation of the lectin complement pathway by ficolins[J]. Int Immunopharmacol，2001，1(3)：359-363.

[6] Kakinuma Y，Endo Y，Takahashi M，et al. Molecular cloning and characterization of novel ficolins fromXenopuslaevis[J]. Immunogenetics，2003，55(1)：29-37.

[7] Hargreaves A D，Swain M T，Logan D W，et al. Testing the toxicofera:comparative transcriptomics casts doubt on the single, early evolution of the reptile venom system[J]. Toxicon，2014，92(8)：140-156.

[8] Fujimori Y，Harumiya S，Fukumoto Y，et al. Molecular cloning and characterization of mouse ficolin-A[J]. Biochem Biophys Res Commun，1998，244(3)：796-800.

[9] Le Y，Lee S H，Kon O L，et al. Human L-ficolin:plasma levels, sugar specificity, and assignment of its lectin activity to the fibrinogen-like(FBG)domain[J]. FEBS Lett，1998，425(2)：367-370.

[10] Wu C，Söderhäll K，Söderhäll I. Two novel ficolin-like proteins(FLPs)act as pattern recognition molecules for invading pathogen in the freshwater crayfishPacifastacusleniusculus[J]. Proteomics，2011，11(11)：2249-2264.

[11] Kenjo A，Takahashi M，Matsushita M，et al. Cloning and characterization of novel ficolins from the solitary ascidian,Halocynthiaroretzi[J]. J Biol Chem，2001，276(23)：19959-19965.

[12] Xiang Z，Qu F，Wang F，et al. Characteristic and functional analysis of a ficolin-like protein from the oysterCrassostreahongkongensis[J]. Fish & Shellfish Immunol，2014，40(2)：514-523.

[13] Putnam N H，Butts T，Ferrier D E，et al. The amphioxus genome and the evolution of the chordate karyotype[J]. Nature，2008，453(7198)：1064-1071.

[14] Zhou Z C，Dong Y，Sun H J，et al. Transcriptome sequencing of sea cucumber(Apostichopusjaponicus)and the identification of gene-associated markers[J]. Mol Ecol Resour，2014，14(1)：127-138.

[15] Larkin M A，Blackshields G，Brown N P，et al. Clustal W and Clustal X version 2.0[J]. Bioinformatics，2007，23(21)：2947-2948.

[16] Yang A F，Zhou Z C，He C B，et al. Analysis of expressed sequence tags from body wall, intestine and respiratory tree of sea cucumber(Apostichopusjaponicus)[J]. Aquaculture，2009，296(3/4)：193-199.

[17] Pfaffl M W，Horgan G W，Dempfle L. Relative expression software tool (REST©)for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR[J]. Nucleic Acids Research，2002，30(9)：36.

[18] Chen Z，Zhou Z C，Yang A F，et al. Characterization and expression analysis of a complement component gene in sea cucumber(Apostichopusjaponicus)[J]. J Ocean Univ China，2015，14(6)：1096-1104.

[19] 高杉，董颖，王摆，等. 仿刺参铜锌超氧化物歧化酶基因全长cDNA的克隆及表达分析[J]. 水产科学，2014，33(5)：288-294.

[20] 董颖，高杉，陈仲，等. 仿刺参profilin基因全长cDNA的克隆及表达分析[J]. 中国农业科技导报，2013，15(2)：159-167.

[21] Lynch N J，Roscher S，Hartung T，et al. L-ficolin specifically binds to lipoteichoic acid, a cell wall constituent of Gram-positive bacteria, and activates the lectin pathway of complement[J]. J Immunol，2004，172(2)：1198-1202.

[22] Aoyagi Y，Adderson E E，Min J G，et al. Role of L-ficolin/mannose-binding lectin-associated serine protease complexes in the opsonophagocytosis of type Ⅲ group B streptococci[J]. J Immunol，2005，174(1)：418-425.

[23] Sugimoto R，Yae Y，Akaiwa M，et al. Cloning and characterization of the Hakata antigen, a member of the ficolin/opsonin p35 lectin family[J]. J Biol Chem，1998，273(33)：20721-20727.

MolecularCharacterizationsandExpressionofFicolininSeaCucumberApostichopusjaponicus

CHEN Zhong, YANG Aifu, WANG Bai, JIANG Jingwei, GAO Shan, DONG Ying, ZHOU Zunchun

( Liaoning Key Lab of Marine Fishery Molecular Biology, Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute, Dalian 116023, China )

We identified the cDNA sequence of ficolin gene from sea cucumber (Apostichopusjaponicus) through RNA-seq sequencing and RACE (rapid amplification of cDNA ends) technology, and the protein known as AjFCN had length of 1951 bp including a 397 bp 5′ untranslated region (UTR), a 666 bp 3′-UTR and an ORF of 888 bp encoding 295 amino acids. The AjFCN protein contained a typical signal peptide, two G-X-Y repetitive sequences and abrinogen-like domain (FBG). The relative expression of AjFCN gene was detected by the qRT-PCR in the intestine, respiratory tree, coelomocyte and body wall, with the maximal expression level in the intestine. After lipopolysaccharide (LPS) challenge, the expressions in intestine and body wall tissues were changed most dramatically. Furthermore, the relative expression levels of AjFCN gene in the four tissues showed different time-sequence patterns. The findings indicated that the AjFCN played an important role in the immune response of sea cucumber.

sea cucumber (Apostichopusjaponicus); ficolin; sequence analysis; gene expression; LPS challenge

10.16378/j.cnki.1003-1111.2017.03.007

Q786

A

1003-1111(2017)03-0296-07

2016-07-01；

2016-08-21.

辽宁省科技计划项目(2014203006)；辽宁省海洋与渔业厅项目(201605)；大连市科技计划项目(2013J21DW025).

陈仲(1980—)，男，工程师，硕士；研究方向：海洋生物技术.E-mail：ch_zhong@163.com. 通讯作者：周遵春(1967—)，男，研究员，博士；研究方向：海洋生物技术.E-mail：zunchunz@hotmail.com.