吴星星（新疆乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心 830063）

一起鸽新城疫感染快速诊断

吴星星（新疆乌鲁木齐市动物疾病控制与诊断中心 830063）

为查找引起新疆某养鸽场鸽群突然发病大量死亡病原，控制疫情蔓延。通过流行病学和病理解剖观察，然后采集病死鸽子肝脏、肺脏、喉头和气管等脏器组织，提取RNA，分别对其进行禽流感荧光RT-PCR检测和新城疫RT-PCR检测。诊断出该鸽场疫情由鸽新城疫病毒感染引起。建议预防控制好鸽场新城疫的发生，除日常免疫接种外，全面做好鸽场生物安全防护及研制鸽新城疫专用疫苗更是今后的一个努力方向。

鸽新城疫；RT-PCR；荧光RT-PCR

鸽新城疫俗称鸽瘟，是流行于鸽群中的一种高度接触性、败血性、急性传染病，由新城疫病毒的一种变异株鸽I型副病毒（Pigeon Paramyx-Ovirus Type I， PPMV-1)引起[1]。该病临床特征与鸡新城疫相似，但主要以腹泻和神经症状为主[2-3]，自我国于1985年在进口鸽中首次检出后，全国各地均有发生，其中包括新疆[4-5]。该病一年四季以秋冬、冬春多发，不同品种、年龄的鸽子均可感染，通过尘埃、污染的器具、饲料和饮水等因素迅速传播，发病率为80～90%以上，给养鸽业造成严重的经济损失，目前已成为养鸽业重点防控的传染病。一般通过临床症状和剖检病变可对该病作出初步诊断，但要确诊还需借助实验室诊断。用传统方法诊断鸽I型副病毒感染需要作病原分离鉴定，其过程需经多次鸡胚传代，费时费力，常耽误疫情控制的宝贵时机，给养鸽业造成惨重的经济损失[6]，而近年来发展起来的RT-PCR检测技术操作方便结时、检测特性敏感、特异可实现该病的快速诊断，非常适宜基层推广使用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料

新疆某养鸽场病死鸽子的肝脏、肺脏、喉头和气管等脏器组织。

1.1.2 设备及试剂

荧光PCR仪，梯度PCR仪均购自美国ABI公司、组织研磨仪购自法国Bertin公司、高速冷冻离心机购自德国Sigma公司、禽流感荧光RT-PCR检测试剂盒购自深圳凯杰生物技术有限公司，新城疫病毒RT-PCR检测试剂盒购自北京世纪元亨生物技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 发病情况及流行病学调查

该鸽场共饲养鸽子7000羽，冬季11月份经本地引进一批乳鸽，随后鸽群出现大批量死亡，达3500羽。病鸽临床症状表现为精神萎靡，采食减少，饮水增多，排黄绿色稀薄粪便，部分病鸽出现两翅下垂、头颈歪斜、站立不稳或卧地不起等一系列神经症状。

1.2.2 病理剖检变化

病死鸽肛门周围及腹部后驱羽毛粘黄绿色稀粪，胸、颈部皮下出血，腺胃乳头出血，肠道弥漫性出血，肠系膜淋巴结出血水肿，喉头、气管内有浆液物质渗出，肺、气管充血、出血，肝脏肿大，出血、瘀血严重。

1.2.3 实验室诊断

根据鸽群疫病流行特征，结合临床症状及病理解剖变化，采集病变明显的脏器组织，同时进行禽流感与新城疫病毒的分子生物学检测。

（1）病毒总RNA的提取

将采集的病死鸽肝脏、脾脏、肺脏等组织与PBS稀释液(pH=7.2)按1∶8比例混合，用研磨器将组织彻底研磨，放于高速冷冻离心机中，8000rpm/h，离心8min后取出，吸取离心上清液，按照商品化试剂盒操作说明，提取病毒总RNA备用。

（2）禽流感病毒荧光RT-PCR扩增

取一灭菌离心管，根据反应配置体系，分别加入反应液，荧光探针、酶以及核酸，混合均匀成25ul体系，置于荧光PCR反应仪中，反应作用90min，结果判定：CT值为none的样本为阴性。CT值≤30.0的样本为阳性，CT值＞30.0的样品建议重做，重做结果CT值为none为阴性，否则为阳性。

（3）新城疫RT-PCR扩增

取灭菌的离心管，根据反应配置体系，分别加入反应液，DNA聚合酶及反转录酶以及核酸，混合均匀成25ul体系，置于荧光PCR反应仪中，反应作用2h，读取的结果如图2所示。结果判定：出现362bp大小条带的样本为阳性，未出现362bp大小条带的样本为阴性。

1.3 结果

对4份鸽内脏组织进行禽流感病毒荧光RT-PCR扩增，结果如图1显示：阳性对照成立（CT值=22.14），并出现明显的S型曲线，而4份组织样品与阴性对照样品一致未出现S型扩增曲线，表明4份样品均不存在禽流感感染。

图1 禽流感荧光RT-PCR检测结果

对4份鸡内脏组织进行新城疫RT-PCR扩增，结果如图2显示：新城疫阳性对照成立：出现362bp扩增条带，4份样品与阳性对照一致也出现362bp扩增条带，表明4份组织样品均为新城疫病毒感染。

图2 新城疫RT-PCR检测结果

1.4 处理措施

立即将发病鸽与健康鸽隔离、扑杀，同时彻底清除病死鸽粪便等排泄物以及污染的饲料、垫料等进行无害化处理，对污染的器具、鸽舍墙面、地面环境等连续消毒一周，全场鸽群进行新城疫疫苗紧急免疫接种，同时用多维与黄芪多糖饮水，连用7d。

2 结果与分析

通过实验室检诊断，结合鸽场流行病学调查、临床表现、病理解剖变化得出，该鸽场不存在禽流感感染，发生的疫情由鸽新城疫与鸽沙门氏菌混合感染引起。分析具体成因如下。

2.1 乳鸽母源抗体水平低

母源抗体对鸽新城疫免疫应答具有很大影响，种鸽经过新城疫疫苗接种后，可将其抗体通过卵黄传递给乳鸽，乳鸽在3日龄抗体滴度最高，以后逐渐下降，具有母源抗体的乳鸽具有一定的抵抗力，为此推测引进乳鸽的种鸽可能未接种过新城疫疫苗或者虽然接种过疫苗，但由于免疫失败或引进的乳鸽其母源抗体刚好处于最低水平或消失阶段，加上乳鸽自身抵抗力差，可能通过野禽和不良的饲养环境及方式等一系列内外因素导致感染鸽新城疫毒株，再作为传染源传染给健康鸽群。

2.2 鸽场缺乏畜禽调运检疫知识

引进前未向来源地索取相关疫病检疫证明，且未做好自主性本地抽样检疫的疫病防范工作，其次生物安全措施不到位，将引进的外观健康病鸽与原有鸽群做上下楼同楼饲养，未进行完全的隔离饲养观察，使病原通过空气、污染的饲料、饮水、用具、病鸽分泌物、排泄物等途径传播，这是导致疫情发生的直接原因。

3 讨论

鸽新城疫感染的快速诊断是鸽病防治实践中的一道难题。而RT-PCR技术克服了传统检测方法费时费力的特性，以其快速、敏感、特异的优点为有效进行鸽新城疫的临床诊断、流行病学调查及分子生物学研究工作开展提供了快速的手段。国内王林川等对3个中国广东鸽新城疫病毒分离株进行了RT-PCR目的条带的扩增，与预期扩增结果一致；刘小银等从疑似鸽瘟的6例临床病例中分离到5株鸽新城疫病毒，用RT-PCR方法扩增F蛋白裂解位点的基因片段，并进行克隆、序列测定，分析表明，鸽新城疫的F蛋白的基因片段裂解位点处的3个序列与新城疫强毒在这一区域序列相符；2008年张兆敏等对成都某鸽场大批死亡，出现下痢和歪头缩颈等明显神经症状临及剖检变化有全身性的黏膜和浆膜出血的病死鸽子进行细菌分离鉴定及新城疫RT-PCR检测，确诊为鸽新城疫。阎玉河等根据NDV基因结构特点及强、弱毒株裂解位点的序列差异设计2对引物，建立了快速诊断RT-PCR技术，该方法具有快速、特异、操作简便等特点，不仅适用于鸡胚的检测，也适用于对病鸡组织匀浆液的检测。该技术可帮助广大养鸽业者迅速准确的查明病原，及时实施防疫措施控制疫情的发生蔓延，将经济损失降到最低[6-9]。

目前，在鸽新城疫疫病预防中，由于专用鸽新城疫疫苗还未见上市，主要使用鸡新城疫疫苗进行预防，但在实际应用中，免疫保护效果往往不理想，免疫失败现象时有发生，造成鸽场严重的经济损失[10]。为此，在预防鸽新城疫工作中应进行科学饲养管理，坚持全进全出饲养方式，不断完善防疫设施设备与防疫措施，保持舍饲良好的通风环境，定期做好日常防疫消毒工作，其次快速研究出鸽新城疫专用疫苗预防鸽新城疫也是今后发展的一个重点方向。

[1]杨丽云,阮二垒,陈芳艳,等.一株肉鸽新城疫强毒的分离鉴定[J].中国畜牧兽医,2010,37(4):201-204.

[2]任养生,樊振华.鸽新城疫的防治[J].中国兽医医药杂志,1999(4):38-39.

[3]黄鉴明.鸽I型副病毒的诊断[J].中国畜禽传染病,1996(3):39-40.

[4]游洪,王林川.鸽I型副病毒病的研究进展[J].动物医学进展,2001(2):13-16.

[5]崔晓萍,秦爱建,崔治中,等.鸽新城疫病毒的分离及鸽群自然感染状况的调查[J].中国兽药杂志,1997,31(2):6-10.

[6]王林川,游洪,陈芳艳,等.鸽I型副病毒的套式PCR检测方法的建立[J].中国预防兽医学报,2001,23(6):461-462.

[7]刘小银,岳华.快速诊断鸽瘟方法的研究[J].中国家禽,2007,29(11):18-21.

[8]张兆敏,岳华.RT-PCR快速诊断鸽新城疫[J].四川畜牧兽医,2009(4):24-25.

[9]阎玉河,邓瑞广,赵传璧,等.用反转录—聚合酶链式反应鉴别新城疫病毒[J].中国兽医科技,2000,30(1):3-5.

[10]Dortmans J C,Rottier P J,Koch G,et al.Passaging of a Newcastle disease virus pigeon variant in chickens results in selection of viruses with mutations in the polymerase complex enhancing virus replication and virulence[J].J Gen Virol 2011,92(Pt2):336-345.

吴星星（1986-），女，研究生，兽医师，研究方向：动物疫病预防与控制。