郭文娇 李转见 张博文 蓝贤勇 雷初朝 陈宏*

(1，西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室 712100;2，河南农业大学牧医工程学院 450000)

奶山羊miRNA-451表达谱分析及靶基因初步鉴定

郭文娇1李转见2张博文1蓝贤勇1雷初朝1陈宏1*

(1，西北农林科技大学动物科技学院陕西省农业分子生物学重点实验室 712100;2，河南农业大学牧医工程学院 450000)

基于实验室应用高通量测序得到的奶山羊泌乳峰期和干奶期乳腺组织中小RNA结果的基础上，利用实时荧光定量PCR、基因克隆、重组腺病毒以及细胞培养等技术并结合生物信息学的方法，对miRNA-451的表达谱及其靶基因进行了预测与验证分析。miRNA-451在不同组织和不同泌乳时期乳腺组织中的表达量结果显示：miRNA-451在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪、卵巢组织表达量都很低，在4个泌乳时期（泌乳前期、泌乳峰期、泌乳末期和干奶期）的变化与泌乳曲线的变化有相似之处，同时在泌乳4个时期有逐渐降低趋势。本研究构建了携带奶山羊miRNA-451前体序列404bp的重组腺病毒载体。双荧光素酶报告检测系统检测结果表明，CAST基因为miRNA-451的靶基因。

奶山羊；miRNA-451；表达谱分析；靶基因

miRNA是一种22个核苷酸（nt)左右的单链小分子RNA。它的发现开启了人类认识非编码RNA的新篇章，miRNA在生物的生长过程中参与了细胞的增殖、分化、生物发育及代谢等许多生物学过程，同时也在疾病发生发展过程中扮演了重要的角色[1]。miRNA在乳腺发育过程中具有重要作用。Liu等[2]首次利用miRNA芯片扫描了人的全基因组miRNAs，结果在乳腺组织中发现有23种miRNAs的表达量较高，但和其他21个组织中发现的miRNAs数量相比，乳腺组织中发现miRNAs的数目较少。Iorio等[3]研究表明，miRNA-125b在乳腺发育的各个阶段都处于高表达状态。在乳腺癌组织中miRNA-125b处于表达量较低，这表明抑制miRNA-125b的表达对乳腺上皮细胞的分化具有破坏作用。Silveri等[4]利用Northern blot的方法分析发现在小鼠的乳腺中有9种特异表达的miRNAs。Wang等[5]应用miRNA芯片已分析出在小鼠的怀孕和哺乳期miRNA-138和miRNA-431有下调的作用，而miRNA-133和miRNA-133a-133b具有上调的作用。Gu等[6]研究发现 miRNA-21，miRNA-23a，miRNA-24和miRNA-143在乳腺的生长和发育期这些miR-NAs发挥着重要的功能。Tanaka等[7]研究表明，miRNA-101a对乳腺上皮细胞的发育和分化具有调控作用。Avril-Sassen等[8]研究发现，在乳腺发育过程中miRNA的表达可能共同来调节一些集群，而在这些集群中与乳腺癌相关的miRNAs表达量显著增高，影响这些miRNAs共同调节的机制和功能为我们提供了一条新的研究乳腺生物学的途径。Cui等[9]的研究表明，miRNA-126-3p对乳腺上皮细胞的增殖有调控作用，其通过与其靶基因--孕酮受体（PGR）的3′UTR结合从而发挥作用的。

目前关于miRNA-451研究主要集中在癌症上。Scholl等研究发现，miRNA-451在诊断中的表达水平与IM疗法有相关性[10]；Cheng等研究发现，miRNA-451靶向干扰素调节因子参与全身性红斑狼疮的发生[11]。巢海潮等分析发现，miR-451在不同膀胱癌细胞中差异表达，其表达异常可影响癌细胞生物学功能[12]。Pigati等研究表明，miR-451在正常乳腺上皮细胞高表达[13]。miRNA-451的超表达可以抑制细胞周期的进程、细胞的迁移、入侵和促进非小细胞肺癌细胞的凋亡。本研究以西农萨能奶山羊泌乳峰期和干奶期的乳腺组织为研究材料，基于本实验室以前的高通量测序及分析结果[14]，鉴定与奶山羊乳腺泌乳生理密切相关的miRNA-451及其靶基因，为西农萨能奶山羊的定向选育提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 组织样品的采集与总RNA的提取

健康的成年西农萨能奶山羊母羊（3周岁），采自杨凌姚南新村屠宰场。采取Trizol法提取西农萨能奶山羊乳腺组织，及心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、肌肉、脂肪、卵巢组织的总RNA。

1.2miRNA的定量分析

依据Chen等人提出的Stem-loop实时定量PCR的方法自行设计了特异性的反转录引物及相应的PCR引物，本研究根据牛miRNA-451的序列（NC_007317.5)克隆出miRNA-451前体序列404 bp，设计带有SalⅠ、HindⅢ酶切位点的引物，见表1。

1.3 奶山羊miRNA-451靶基因预测

根据Allen[15]和Schwab[16]方法和原则进行miRNA的靶基因预测，同时利用TargetScan在线软件预测了miRNA-451的靶基因，即ING3、FLT-1、CAST基因。

1.4 候选靶序列的扩增引物设计

根据NCBI GenBank数据库的牛ING3（NC_007302.5）、FLT-1（NC_007310.5）、 CAST（NC_007305.5） 基因的序列设计引物（表2），扩增预测靶位点两侧目的片段。

1.5 统计分析

利用SPSS 20.0软件中单因素方差分析以及Dunnett's多重比较统计两组间的差异。*：＜0.05； **：＜0.01。

2 结果与分析

2.1 乳腺发育相关的miRNA-451的表达谱分析

如图1表达谱分析结果，肝脏（Liver，Li）、肺脏（Lung， Lu）、 心脏（Heart He）、 肾脏（Kidney， Ki）、 肌肉（Skeletal muscle， Mu）、 脾脏（Spleen， Sp）、 脂肪（Inner Fat，Fa）和卵巢组织（Ovary，Ov））和不同的泌乳时期乳腺组织（泌乳前期（30 DAL）、泌乳峰期（75 DAL）、泌乳末期（200 DAL）和干奶期（320 DAL））。MiRNA-451在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪、卵巢组织表达量都很低，在泌乳前期、泌乳峰期、泌乳末期和干奶期的变化与奶山羊泌乳曲线的变化有些相似，同时在泌乳的4个时期有逐渐降低的趋势。总体来说，奶山羊乳腺组织的miRNA-451在乳腺组织中表达量相对较高，并且在不同泌乳时期的表达存在显著差异。

表1 miRNA-451实时定量引物信息

表2 候选基因引物

图1 miRNA-451的表达谱分析

2.2 miRNA-451腺病毒过表达载体的构建与转染

2.2.1 重组质粒表达载体的构建

克隆得到了包含miR-451前体的目的片段，并将该目的片段与载体pAdTrack-CMV重组，得到重组载体pAdTrack-CMV-miRNA-451，双酶切鉴定结果证明该载体构建成功。pAdTrack-CMV-miRNA-451载体与骨架载体pAdEasy-1进行同源重组，得到重组质粒pAd-miRNA-451，酶切结果表明腺病毒重组成功。

2.2.2 重组腺病毒表达载体的包装和扩增与最佳滴度确定

重组质粒pAd-miRNA-451线性化后，转染至293A细胞，2 d后在荧光显微镜下可观察到细胞中有绿色荧光，第7天可观察到噬菌斑，说明细胞出现病变，9d后80%细胞游离脱落，此时收集的病毒为第一代病毒，反复感染3次后得到高滴度的病毒。

取生长状态良好的293T细胞铺于6孔板中，将包装好的腺病毒载体pAd-miRNA-451和腺病毒空对照载体pAd-Control（由本实验室保存）分别感染293T细胞。pAd-miRNA-451 的 MOI为 150、 200、 250， pAd-Control的 MOI为50、100、150，每组重复3次，72h后观察其绿色荧光表达情况，最佳的MOI为荧光强度亮并且细胞形态不变时的腺病毒感染量。pAd-miRNA-451的最佳MOI为200，pAd-Control的最佳MOI为100，如图2所示：

图2 转染腺病毒后的293T细胞（100×）

2.2.3 重组腺病毒在293T细胞中的表达情况

取生长状态良好的293T细胞铺于6孔板中，当细胞融合度达到90%时，根据最佳MOI，感染293T细胞，并设置对照，每组3个重复。72 h后提取细胞内的RNA，进行实时荧光定量。结果显示，试验组重组的过表达腺病毒pAdmiRNA-451的表达量是对照组重组的过表达空载体pAd-Control的27倍（如图3），差异极显著。此结果说明，本研究构建的重组腺病毒pAd-miRNA-451能高水平的表达目标基因，为以后继续研究miRNA-451调控乳腺上皮细胞的作用及机制以及对奶山羊泌乳的调控提供一定的实验基础。

2.3 奶山羊miRNA-451靶基因的初步研究

2.3.1 靶基因的预测

图3 pAd-miRNA-451在293T细胞中的表达

利用预测软件预测靶基因，并结合Grimson等[17]提出的miRNA靶位点的序列特征，获得如下较为可信的靶位点：ING3（inhibitor of growth family，member 3，生长抑制因子3基因）；CAST（calpastatin，钙蛋白酶抑制蛋白）；FLT-1（fms-related tyrosine kinase 1，fms相关的酪氨酸激酶1），如图4。

图4 靶基因预测AING3基因；B CAST基因；C FLT-1基因

2.3.2 对应山羊靶基因序列的扩增与比对

经PCR克隆与测序，获得山羊的序列后，利用序列分析软件BioXM 2.6进行序列的同源性和保守性分析。分析结果如图5。

2.3.3 psiCHECK-2载体构建与鉴定

克隆ING3和CAST基因上miRNA-451的靶序列，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。将扩增得到的片段与psiCHECK-2载体连接，得到含有目的基因3'UTR的双荧光素酶报告载体。用Overlap PCR的方法扩增ING3（图6）和CAST（图7）上miRNA-451的靶序列的突变体。将扩增得到的片段与psiCHECK-2载体连接，得到含有目的基因3'UTR的突变型双荧光素酶报告载体。

2.3.4 双荧光素酶实验

本研究利用双荧光素酶报告检测系统实验鉴定山羊miRNA-451的靶基因。即利用miRNA-451 mimics分别与野生型重组载体（psiCHECK-2-ING3和psiCHECK-2-CAST）和对应的突变型重组载体共转染293T细胞，以单独分别用野生型重组载体和突变型重组载体转染293T细胞为对照。统计海肾荧光素酶的活性变化。分析结果表明，miRNA-451的miScript mimic与psiCHECK-2-CAST共转染的293T细胞中psiCHECK-2-CAST重组质粒表达海肾荧光素酶与对照组的海肾荧光素酶的活性变化显著（＜0.05）（图 8）， 突变分析结果显示miRNA-451的miScript mimic不能使CAST基因突变重组质粒表达的萤火虫荧光素酶活性的降低（图8），说明CAST基因是miRNA-451作用的靶基因。

图5 牛与山羊的靶序列比对注：方框内的序列是预测的与miRNA结合序列；小写字母为错匹配碱基

图6 ING3基因的overlap-PCR电泳图。372bp为上游片段，67bp为下游片段，重合32bp。372+67-32=407

图7 CAST基因的overlap-PCR电泳图。190bp为上游片段，192bp为下游片段，重合32bp。190+192-32=350片

图8 miR-451的CAST靶基因的验证

A预测的miR-451靶基因CAST位点，构建缺失种子区（粗体）的突变体载体。B miR-451 mimics分别与野生型psiCHECK-2-CAST重组载体和突变型psiCHECK-2-CAST重组载体共转染HEK293T细胞，以单独分别用野生型psiCHECK-2-CAST重组载体和突变型psiCHECK-2-CAST重组载体转染HEK293T细胞为对照（*＜0.05)。

3 讨论

很多研究证明，miRNA的表达具有明显的时序和组织特异性。miRNA的特异性表达依赖于特定的生理功能和生理状态。Ji等[17]比较崂山奶山羊泌乳中期和泌乳后期乳腺差异表达情况，发现了1113种保守miRNA和31种新miRNA，其中，697个保守的miRNA表达差异显著，包括272个具有上调功能的miRNA和425个具有下调功能的miRNA，还揭示了这两个不同泌乳阶段中共表达最丰富的10种miRNA（miR-143， miR-143-3p， miR-138a-3p， let-7-5p， let-7b，let-7b-5p， miR-30a， miR-30a-5p， miR-738e， miR-378d）。而本研究发现miRNA-451在乳腺组织中表达量很高，并且在不同的泌乳时期的表达存在显著差异，泌乳峰期miRNA-451的表达量是干奶期表达量的一倍多。

腺病毒具有高效率感染其他细胞的优势，同时可以避免自然腺病毒的毒性对人及其他动物的危害。在基因功能的研究中，腺病毒载体得到了越来越广泛的应用。Russell等[18]通过管内注射重组腺病毒载体到小鼠的乳腺上皮细胞中，发现腺病毒并没有破坏乳腺上皮细胞的正常形态及其功能，这样就可以通过这种非侵害性的方法来研究乳腺上皮细胞这种腔类细胞中基因的功能。本研究中的奶山羊miRNA-451的前体序列长度是404bp属于短片段基因，而腺病毒载体最高可以表达10 kb的基因，因此，腺病毒载体可以高效的表达miRNA-451的前体序列。

本试验主要是通过生物信息学的方法来预测miRNA的靶基因。由于没有专门预测山羊靶基因的数据库，只能利用物种间的同源性来预测。利用TargetScan在线软件和一些靶基因的预测规则进行预测。最后通过基因功能确定ING3、CAST和FLT-1为候选靶基因，又进一步通过克隆及同源性的比对最终确定了ING3和CAST为候选的靶基因。

因为miRNA-451在泌乳峰期的乳腺组织中是上调的，而miRNA-451在转录后抑制靶基因的表达。因此，本研究结合靶基因的预测筛选了一些在乳腺发育或泌乳生理过程中具有负向调控的基因。构建野生型和突变型靶序列的双荧光报告载体，利用双荧光检测系统检测荧光素酶活性的变化，据此来判断miRNA与某一特定的靶基因识别情况。这种方法在miRNA靶基因验证研究中广泛应用[19-22]。293T细胞在这里只是工具，在研究中只利用细胞的翻译系统，所以实验得出的结果是可靠的和具有普遍性的。本研究中利用双荧光素酶报告实验证明了CAST基因为miRNA-451的靶基因。

[1]Kloosterman,W.P.,E.Wienholds,R.F.Ketting,et al.Substrate requirements for let-7 function in the developing zebrafish embryo[J].Nucleic Acids Res,2004,32:6284-6291.

[2]Liu,C.G.,G.A.Calin,B.Meloon,et al.An oligonucleotide microchip for genome-wide microRNA profiling in human and mouse tissues[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2004,101:9740-9743.

[3]Iorio,M.V.,M.Ferracin,C.G.Liu,et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer[J].Cancer research,2005,65:7065-7068.

[4]Silveri,L.,G.Tilly,J.L.Vilotte,et al.MicroRNA involvement in mammary gland development and breast cancer[J].Reprod.Nutr.Dev,2006,46:549-556.

[5]Wang,Y.M.,D.L.Dai,M.Martinka,Prognostic significance of nuclear ING3 expression in human cutaneous melanoma[J].Clin.Cancer Res,2007,13:4111-4116.

[6]Gu,Z.,S.Eleswarapu,and H.Jiang.Identification and characterization of microRNAs from the bovine adipose tissue and mammary gland[J].FEBS Letters,2007,581:981-988.

[7]Tanaka,T.,S.Haneda,K.Imakawa,et al.A microRNA,miR-101a,controls mammary gland development by regulating cyclooxygenase-2 expression[J].Differentiation,2009,77:181-187.

[8]Avril-Sassen,S.,L.D.Goldstein,J.Stingl,et al.Characterisation of microRNA expression in post-natal mouse mammary gland development[J].BMC Genomics,2009,10:231-242.

[9]Cui,W.,Q.Z.Li,L.Feng,et al.MiR-126-3p regulates progesterone receptors and involves development and lactation of mouse mammary gland[J].Mol.Cell.Biochem,2011,355:17-25.

[10]Cheng J,Wu R,Long L,et al.miRNA-451a Targets IFN Regulatory Factor 8 for the Progression of Systemic Lupus Erythematosus[J].Inflammation,2017:1-12.

[11]巢海潮,董志峰,张古月,等.miRNA-451在膀胱癌细胞中的表达及对其生物学功能的影响 [J].临床与病理杂志,2016,36(9):1350-1355.

[12]Pigati L,Yaddanapudi SC,Iyengar R,Kim DJ,Hearn SA,Danforth D,Hastings ML,Duelli DM.Selective release of microRNA species from normal and malignant mammary epithelial cells[J].PLoS One.2010,5(10):e13515.

[13]Scholl,V.,R.Hassan,and I.R.Zalcberg.miRNA-451:A putative predictor marker of Imatinib therapy response in chronic myeloid leukemia[J].Leukemia Research,2012,36:119-121.

[14]Zhuanjian Li,Xianyong Lan,Wenjiao Guo,et al.Comparative Transcriptome Profiling of Dairy Goat MicroRNAs from Dry Period and Peak Lactation Mammary Gland Tissues[J].PLoS ONE,2012,7(12):e52388.

[15]Allen,E.,Z.Xie,A.M.Gustafson,et al.microRNA-directed phasing during trans-acting siRNA biogenesis in plants[J].Cell,2005,121:207.

[16]Schwab,R.,J.F.Palatnik,M.Riester,et al.Specific effects of microRNAs on the plant transcriptome[J].Developmental cell,2005,8:517-527.

[17]Grimson,A.,K.K.-H.Farh,W.K.Johnston,P.Garrett-Engele,L.P.Lim,and D.P.Bartel.2007.MicroRNA targeting specificity in mammals:determinants beyond seed pairing[J].Mol Cell.27:91-105.

[17]Ji,Z.,G.Wang,Z.Xie,J,et al.Identification of Novel and Differentially Expressed MicroRNAs of Dairy Goat Mammary Gland Tissues Using Solexa Sequencing and Bioinformatics[J].PloS one,2012,7:e49463.

[18]Russell,T.D.,A.Fischer,N.E.Beeman,et al.Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo[J].J.Virol,2003,77:5801-5809.

[19]Liu Y,Huang H,Liu M,Wu Q,Li W,Zhang J.MicroRNA-24-1 suppresses mousehepatoma cell invasion and metastasis via directly targeting O-GlcNActransferase[J].Biomed Pharmacother,2017,91:731-738.

[20]Bao H,Yao QP,Huang K,Chen XH,Han Y,Jiang ZL,Gao LZ,Qi YX.Platelet-derived miR-142-3p induces apoptosis of endothelial cells inhypertension[J].Cell Mol Biol,2017,63(4):3-9.

[21]Wu F,Li J,Guo N,Wang XH,Liao YQ.MiRNA-27a promotes the proliferation and invasion of human gastric cancer MGC803 cells by targeting SFRP1 viaWnt/β-catenin signaling pathway[J].Am J Cancer Res,2017,7(3):405-416.

[22]Zhang S,Wang R,Su H,Wang B,Sizhu S,Lei Z,Jin M,Chen H,Cao J,Zhou H.Sus scrofa miR-204 and miR-4331 Negatively Regulate Swine H1N1/2009 Influenza AVirus Replication by Targeting Viral HA and NS,Respectively[J].Int J Mol Sci,2017,18(4).pii:E749.

本研究由高等学校博士学科点专项科研基金（博导类）、西农萨能奶山羊泌乳生理相关miRNA调控机理研究（20120204110007）、西北农林科技大学基本科研费项目（No.QN2011102)、西农萨能奶山羊乳腺泌乳相关miRNAs的鉴定及其调控泌乳性能研究（QN2011102）资助完成。

郭文娇（1987-），女，陕西省西安市人，硕士研究生，研究方向：动物遗传学。

陈宏，教授，研究方向：生物技术与家畜育种。