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(贵州大学， 贵阳 550025)

巴西、印度玉米材料新选自交系的遗传多样性研究

张开武，彭忠华

(贵州大学， 贵阳 550025)

利用SSR分子标记技术，选用均匀覆盖玉米基因组的32对带型稳定、多态性好的引物，研究了 33份巴西、印度玉米材料新选的自交系和6份国内标准测验种的遗传多样性。结果表明，32对引物总共检测到147个等位基因；每对引物检测到的基因位点变化范围为3～8个,平均为4.59个；每个SSR标记位点的多态信息量(PIC)变化幅度为0.546 4～0.862 4,平均为0.732 6；39份自交系间的遗传相似系数幅度为0.156 2～0.843 7 ，平均值为0.517 7。按UPGMA聚类方法，39份自交系可以划分为6大类型，与已知系谱来源基本一致。初步划分了杂种优势群。

巴西、印度玉米； 遗传多样性； 聚类分析

玉米是我国重要的粮食、饲料和工业原料，在国家粮食安全战略和社会经济发展中占有至关重要的地位。“粮安天下，种铸基础”，种质资源是玉米育种的物质基础，优异的玉米种质资源的挖掘、发现与利用是玉米育种成功的关键。自“杂种优势”概念的提出及运用于玉米育种实践后，随着玉米杂交种的推广，玉米种质资源的匮乏且遗传基础狭窄已经成为玉米育种界的共识。20世纪70年代开始，我国便开始从墨西哥、中南美洲等玉米起源和遗传多样性中心引进了热带、亚热带玉米种质资源。在热带、亚热带独特的自然环境下的玉米材料生长茂盛，根系发达，持绿性好，使其在不良环境下具有较强的抗病性和抗逆性等优点。由于热带、亚热带玉米的光温反应较强，且与温带玉米种质交流少，遗传差异大，故而与温热种质互导成为种质改良的重要手段之一。巴西、印度玉米材料不仅具有热带、亚热带种质资源的优点，而且还具有较高配合力等特点。目前，玉米育种主要是利用“杂种优势”、“难在选系，重在组配”。关键是对亲本遗传系谱关系以及亲本所在杂种优势群的挖掘与利用。SSR(Simple Sequence Repeat)标记又称微卫星DNA(Micro-satellite DNA )，具有高度重复性、稳定可靠性、多态性高等优点，SSR标记是鉴定玉米种质资源亲缘关系的有效途径之一。因此，本研究利用SSR分子标记对33份巴西、印度玉米新选自交系和6份国内标准测验种进行遗传多样性分析，旨在分清33份巴西、印度玉米自交系之间的遗传系谱关系及其所在的杂种优势群。为利用巴西、印度玉米材料提供一定的理论基础，从而在玉米育种实践中避免盲目性，提高玉米育种的工作效率。

1 材料与方法

1.1 材 料

本实验的33份巴西、印度玉米新选自交系和6份国内标准测验种材料名称及系谱来源见表1，其中名称为96、101、206、340、342、393的为标准测验种材料，其余为巴西、印度玉米材料选系。

1.2 方 法

1.2.1 DNA的提取

将39份自交系材料各取4～5粒种子在恒温箱下培养，至长出2、3片叶时取样，采用CTAB法提取DNA。将样品DNA浓度稀释至60 ng/μL，保存于-20 ℃冰箱中备用。

1.2.2 SSR引物来源

本研究以DL 2000片段为DNA Maker，选择90对均匀覆盖全部玉米基因组的SSR引物，根据玉米遗传和基因组数据库(http//www.maizegdb.org)提供的SSR引物系列信息，从中筛选出32对带型稳定、多态性好的引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 玉米材料及其来源

编号名称系谱来源编号名称系谱来源195 K07(印度材料)选系21223 8201(巴西材料)杂株选系296 兰卡斯特选系22230 F19(巴西材料)×墨白选系397 Bdsd265(印度材料)选系23236 171(巴西材料)×F19(巴西材料)选系4101 瑞德选系24240 奥瑞金×8201(巴西材料)选系5102 K07(印度材料)选系25250 171(巴西材料)×F19(巴西材料)选系6103 Bdsd87⁃1(印度材料)选系26263 F19(巴西材料)×墨白选系7105 Bdsd265(印度材料)选系27270 F19(巴西材料选系)8116 Bdsd265(印度材料)选系28274 瑞德×8201(巴西材料)选系9121 K07(印度材料)选系29279 S1371×F19(巴西材料)选系10125 B06(印度材料)选系30285 瑞德×F19(巴西材料)选系11130 瑞德×8201(巴西材料)选系31293 瑞德×8201(巴西材料)选系12131 地方品种×F19(巴西材料)选系32327 Bdsd265(印度材料)选系13133 黄C×8201(巴西材料)选系33340 贵州地方种选系14135 B06(印度材料)选系34342 旅大红骨改良系15137 B06(印度材料)选系35350 Bdsd265(印度材料)选系16141 S137×F19(巴西材料)选系36363 Bdsd265(印度材料)选系17149 Bdsd87⁃1(印度材料)选系37377 171(巴西材料)杂株选系18159 171(巴西材料)杂株选系38393 苏湾1群体19193 8201(巴西材料)杂株选系39396 兰卡×8201(巴西材料)选系20206 78599选系

1.2.3 PCR扩增、凝胶电泳、银染、显影

PCR扩增体系10μL，反应程序如下：

预变性94 ℃ 5 min，1个循环；变性94 ℃ 30 s，退火58 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s,35个循环；延伸72 ℃ 10 min，1个循环；4 ℃保存。

制备10%的聚丙烯酰胺凝胶，将变性的PCR 产物2μL加入点样孔，在DYY-6 C型电泳仪上电压360 V，电泳40 min左右；然后取下胶，固定，银染，显影。具体方法可参考CIMMYT《Laboratory protocols》，实际操作过程中可适当作改进。

1.3 数据统计分析

根据PCR扩增产物电泳银染结果显示,在相同迁移位置上,有带记为1,无带记为0,缺失记为9，按照NTSYS 2.10 e软件要求在Excel 2003上建立数据库。

按公式GS=a/(a+b),GD=1-GS 分别计算自交系间的遗传相似系数(Genetic Similarity )和遗传距离(genetic distance),其中a表示基因型间共有带数目;b表示基因型间差异带数目。

按公式PIC=1-∑Pi2计算多态性信息量(polymorphism information content),其中Pi表示i 位点的等位基因频率。

聚类分析按UPGMA(Unweighted Pair Group Method using Arithmeti Average)方法进行。 利用NTSYS 2.10 e软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 SSR检测结果分析

32对引物对39份玉米自交系材料检测到的等位基因数及多态性信息量(表2)。

由表2可以看出,在这39份玉米自交系中,32对引物总共检测到147个等位基因，每对引物检测到的基因位点变化范围为3～8个,平均为4.59个，每个SSR标记位点的多态信息量(PIC)变化幅度为0.546 4～0.862 4,平均为0.732 6.其中引物umc 1505位点的PIC值(0.546 4)最小,引物umc 1239位点的PIC值(0.862 4)最大。多态信息量(PIC)取决于检测的等位基因的数目和它们的频率分布。通常用来衡量座位多态性高低的程度。自交系群体PIC值越大，表明该群体的变异程度越高，在本研究中，每个SSR标记位点的多态信息量(PIC)的平均值高达0.732 6，表明了供试的39份玉米自交系遗传差异较大，拥有丰富的遗传多样性基础。

2.2 种质间遗传差异分析

根据32对引物对39份玉米自交系材料扩增结果建立的数据库，利用NTSYS 2.10 e软件计算了这39份玉米自交系间的遗传相似系数(GS)，结果得出相似系数幅度为0.156 2～0.843 7，平均值为0.517 7，其中自交系223和自交系377的遗传相似系数最小(GS=0.156 2)，自交系250和自交系263的遗传相似系数最大(GS=0.843 7)。表明了这39份自交系间有较大的遗传差异，遗传变异范围广。

图1 引物bnlg 125对39份自交系材料的扩增结果

表2 33份巴西、印度玉米自交系和6份国内标准测验种材料用SSR分析鉴定的遗传变异

编号 引物位置等位基因数多态信息量1umc18836．0040．66682bnlg1615．0540．79433umc16811．1170．72394phi0229．0330．71475umc11498．0530．68326umc02312．0340．77537bnlg11894．0760．84158umc11674．0830．71999bnlg19313．0650．774010umc186310．0340．701511bnlg6671．1070．821112umc1538a1．1150．807913bnlg1252．0250．737114umc23813．0640．635215umc21645．0560．850216umc14127．0460．794417phi0316．0460．745118umc58096．0040．582519umc17371．1050．734420umc16124．0840．697621umc17149．0740．693722umc15056．0430．546423umc14949．0550．787924umc11276．0760．781125umc23096．0030．582526umc23327．0480．789627phi2998526．0740．827828umc17956．0530．704829phi0659．0340．739730umc123910．0340．862431umc18474．0750．641732umc16349．0330．6864

2.3 种质间的UPGMA聚类分析

根据PCR扩增结果计算出39份玉米自交系间的遗传相似系数矩阵，按照类平均聚类法(UPGMA)对这39份玉米自交系进行聚类分析，结果如图2。

2.4 喀斯特高海拔山区地方玉米自交系的多样性分析

结果表明，39份自交系按阀值0.53可以划分为6类：自交系95，121，149,206,223,250,263,125,137,193,230为第Ⅰ类，其中自交系206为标准测验种，属于78599选系优势群；自交系342,105,116,103为第Ⅱ类，其中自交系342为标准测验种，应属于旅大红骨杂种优势群；自交系97,102,96,396,159为第Ⅲ类，其中自交系96为标准测验种，属于兰卡斯特杂种优势群；自交系240,141,236,274,135,101,279,270,285,293为第Ⅳ类，101是标准测验种，属于瑞德选系优势群；自交系327,133,130,350,377,363,393为第Ⅴ类，其中393是标准测验种，属于苏湾杂种优势群，自交系340,131为第Ⅵ类，其中自交系340是测验种，属于贵州地方种质杂种优势群。结合已知材料系谱来源分析，这39份玉米骨干自交系的SSR标记聚类结果与系谱来源基本一致，但也有个别材料有所偏差，如自交系130聚在苏湾类群，系谱上其选自瑞德与8201杂株改良材料；而系谱来源于苏湾与巴西材料的自交系141却聚在瑞德杂种优势群种中，出现这样的聚类结果可能是外来种质资源多年来在贵州特殊的立体型气候条件下种植，材料间的杂交打破基因遗传连锁选系的结果；因此SSR分子标记方法用于鉴定玉米自交系材料的系谱来源具有一定的可靠性。

表3 根据SSR分析划分39份玉米自交系的杂种优势群

类群 自交系 备注Ⅰ95，121，149，206，223，250，263，125，137，193，230自交系206为标准测验种，属于78599选系优势群Ⅱ342，105，116，103自交系342为标准测验种，应属于旅大红骨杂种优势群Ⅲ97，102，96，396，159自交系96为标准测验种，属于兰卡斯特杂种优势群Ⅳ240，141，236，274，135，101，279，270，285，293101是标准测验种，属于瑞德选系优势群Ⅴ327，133，130，350，377，363，393393是标准测验种，属于苏湾杂种优势群Ⅵ340，131340是标准测验种，属于贵州地方种质杂种优势群

图2 39个玉米自交系根据SSR数据的聚类分析树状图

3 结论与讨论

本研究采用SSR分子标记，对33份印度、巴西玉米材料新选自交系和6份国内标准测验种进行种质间的遗传多样性分析。结果表明,32对引物总共检测到147个等位基因，每对引物检测到的基因位点变化范围为3～8个,平均为4.59个，每个SSR标记位点的多态信息量(PIC)变化幅度为0.546 4～0.862 4,平均为0.732 6。多态信息量( PIC)取决于检测的等位基因的数目和它们的频率分布。通常用来衡量座位多态性高低的程度。自交系群体PIC值越大，表明该群体的变异程度越高，在本研究中，每个SSR标记位点的多态信息量(PIC)的平均值高达0.732 6，表明了新选的这33份巴西、印度玉米自交系间遗传差异较大，遗传变异范围广，遗传多样性丰富。而运用类平均聚类法(UPGMA)对这39份骨干自交系进行聚类，结果显示，这39份玉米骨干自交系以0.53为阀值，可以分为6大类，与国内6大标准测验种所在杂种优势群的划分一致。表明了可选择SSR分子标记技术作为玉米自交系的系谱来源划分的方法之一。

玉米种质资源匮乏，遗传基础狭窄制约玉米育种的顺利进展，而从国外玉米起源中心引进热带、亚热带种质资源并对其驯化、改良、扩增进而利用，暂时缓解了玉米资源匮乏困境。但是，随着大量国外玉米种质资源的引进，使得国内种质资源和国外种质资源相互渗透而混杂，导致种质资源间的血缘关系混乱不清，而SSR分子标记技术是对自交系材料进行系谱划分的途径之一，从而更加清楚玉米自交系间的血缘关系和系谱来源，提高玉米育种效率，避免盲目性。

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Research on Genetic Diversity of the New Selection Inbred Lines ofCorn Material of Brazil and India

ZHANGKaiwu，PENGZhonghua

2016-11-16

优质高产“贵农玉”系列玉米品种中试与示范(2014 G B 2 F 200259)。

张开武(1985—)，男，贵州凯里人；在读研究生，主要从事玉米遗传育种的研究；E-mail：zhangkaiwu110@163.com。

彭忠华(1967—)，男，贵州遵义人；教授，主要从事玉米遗传育种的教学与研究；E-mail：pzh-1215@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.059

S 513

A

1001-4705(2017)03-0059-04