，

(宜春学院化学与生物工程学院， 江西 宜春 336000)

栀子的psbA-trnH序列分析与鉴别

张兵锋，周秀玲

(宜春学院化学与生物工程学院， 江西 宜春 336000)

对栀子的psbA-trnH片段进行PCR扩展、测序，利用MEGA 6.0进行序列分析，计算样本的遗传距离(Pair-wise distance法)和发育系统树(neighbor-joining 法)。结果表明，10种栀子属的psbA-trnH序列长度为250～297 bp ，A+T平均含量74%，变异位点占24.76%；简约信息位点占6.43%。Pair-wise distance(PW)法计算遗传距离，平均遗传距离为0.058；邻接法(NJ)对栀子属种间的系统发育进行聚类分析，成功鉴别供试样本。psbA-trnH 片段可作为栀子属物种分子鉴别的候选序列。

栀子； psbA-trnH； 分子鉴定； DNA条形码

中药栀子为茜草科(Rubiaceae)栀子属(Gardenia)栀子的果实，其性苦寒，归心、三焦、肺经，无毒，具清热泻火之功效[1]。药理学研究表明，栀子具有保肝利胆、解热镇静的功能，临床上多用于止痛、冠心病、扭挫伤等[2]。栀子主要分布在长江以南的地区，江西为栀子道地性药材的主产区。目前在市场上流通的栀子品种较多，混杂严重，并且质量参差不齐；栀子连续几年价格走低，农户不愿种植；而栀子野生资源破坏严重。因此，为了药材栀子可持续化发展和合理利用，有必要对栀子种源的遗传关系进行分析、鉴定，并以此为依据加强优质栀子的选育。

在分子生药学研究深入的背景下，DNA条形码技术已成为植物药物种鉴定和分类的重要方法，并广泛应用于中药材的基源鉴定，为药材的真伪性、道地性甑别提供了一种稳定、便捷的方法，成为中药材鉴定方面的研究热点[3]。DNA条形码技术是采用物种质体基因或核基因组中一段短小的、通识性的DNA序列来建立直观快速准确的物种鉴定，通过辨别物种间的差异，建立生物身份识别系统[4-5]。一般用来源于质体的trnK-rps 16、psbA-trnH、rp 136-rps 8等和来源于核基因的ITS/ITS 2序列，作为DNA条形码的候选基因序列；在物种鉴定中，单个序列即可成功鉴定物种[6-7]，亦可序列片段组合进行物种鉴定[8]。候选序列中psbA-trnH序列是psbA基因(编码光合系统Ⅱ反应中心的D 1 蛋白)与trnH基因(编码tRNA组氨酸)的间隔序列，被列为被子植物中变异位点最多的序列之一[9]，可用于种间鉴别。本实验拟采用psbA-trnH序列对江西栀子样本栽培黄栀子、重瓣栀子、雀舌栀子和NCBI GENBACK中栀子样本进行序列分析比较，为江西省道地药材栀子的DNA条形码鉴别提供试验依据。

1 材 料

1.1 样品材料

实验材料于2014年11月采于江西省宜春市，栽培黄栀子、重瓣栀子、雀舌栀子植株来源于NCBI GENBACK中栀子属植物，如表1所示。采回的嫩叶样本保存于宜春学院江西省天然药物活性成分研究重点实验室。

表1 栀子样品及源于NCBIGENBACK库的栀子属物种psbA-trnH序列信息

序号代码/ACCESSION名称来源地1LZ栽培栀子江西宜春2GZ重瓣栀子江西宜春3QZ雀舌栀子江西宜春4JX312208GardeniasaxatilisThailand5JX312210GardeniasootepensisThailand6JX312211GardeniaobtusifoliaThailand7JX312213GardeniathailandicaThailand8JX312214GardeniacollinsaeThailand9JX312217GardeniataitensisThailand10JX312218GardeniajasminoidesThailand

1.2 主要试剂和仪器

1.2.1 主要试剂

DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)、DNA回收试剂盒(TIANGEN Midi Purefication Kit)、氯仿、乙醇(分析纯)、Taq酶购于大连宝生物公司，引物由上海生物(工程)有限公司合成。

1.2.2 主要仪器

超低温冰箱(7010702，Thermo)、水浴锅(HH-4)、离心机(Eppendorf-G 5415 R)、PCR扩增仪(BIO RAD T 100 Thermal Cycler)、双稳定时电泳仪(DYY-6 C)、凝胶蛋白检测系统(Gel Doc XB)等。

2 方 法

2.1 栀子样本DNA提取

采用植物基因组DNA提取试剂盒(Plant Genomic DNA Kit，TIANGEN)来提取栀子样品的总DNA(具体操作依据说明书进行)，并采用1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA样本的纯度和相对浓度，合格样本于-20 ℃保存备用。

2.2 栀子样本DNA条形码的PCR扩增及产物纯化

2.2.1 PCR方法步骤

本实验采用psbA-trnH序列的引物为psbA-trnH p 1:5’-gttatgcatgaacgtaatgct c-3’，psbA-trnH p 2:5’-cgcgcatggtggattcacaaatc-3’[10]。PCR反应体系：10×buffer：2μL； MgCl2(25 mmol/L)：2μL；dNTPmix(2 mmol/L)：2μL；Primer-F：1μL；Primer-R：1μL；模板溶液：1μL；Taq酶：0.9μL； ddH2O：10.1μL，总反应体积20μL，每个反应2管。PCR反应程序94 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，35次循环，72 ℃延伸10 min，反应结束4 ℃保存。

2.2.2 PCR扩增产物纯化

PCR产物用TIANGEN的琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(TIANGEN Midi Purefication Kit)进行纯化。

2.3 PCR扩增产物序列的测定

将纯化回收后的产物委托上海生物(工程)有限公司测序。

2.4 序列数据的处理

经过上海生工测序的纯化产物DNA序列用Snapgene Viewer软件打开，拷贝的序列使用软件MEGA(Molecular Evolutionary Genetics Analysis) 6.0进行序列分析，采用Pair-wise distance(PW)法计算遗传距离，邻接法(neighbor joining method)构建NJ系统发育树；系统树的分支置信度采用自举检验法(bootstrap test)检验[11]。

3 结果与分析

3.1 栀子属样本总DNA提取及检测

采用TIANGEN的植物基因组DNA提取试剂盒提取栀子的总DNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测提取的栽培栀子、重瓣栀子、雀舌栀子3个样本的总DNA，结果如图1所示，DNA条带都比较清晰，样本总DNA提取质量较好，可用于引物片段的PCR扩增。

3.2 PCR扩增结果分析

采用psbA-trnH序列通用引物对样本栀子总DNA进行PCR扩增，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示，psbA-trnH 对GZ、LZ、QZ的rDNA进行PCR扩增产物电泳检测总体条带都比较完整明亮，样品PCR扩增产物电泳条带的分子量在250 bp左右，可作为后面测序的实验材料。

表2 10个栀子属植物psbA-trnH序列长度和碱基含量

代码/ACCESSION物种长度(bp)A(bp)T(bp)C(bp)G(bp)A+T(%)G+C(%)LZ栽培栀子28010810122497525GZ重瓣栀子2791089426517228QZ雀舌栀子2741119520487525JX312208Gardeniasaxatilis2521018818457525JX312210Gardeniasootepensis256919821467426JX312211Gardeniaobtusifolia2508510721377723JX312213Gardeniathailandica2971119836527030JX312214Gardeniacollinsae261999220507327JX312217Gardeniataitensis261959423497228JX312218Gardeniajasminoides2721059522507426平均值268．2101．496．222．947．77426

图1 栀子总DNA琼脂糖凝胶电泳图

3.3 psbA-trnH序列特征分析

10个栀子属样本的psbA-trnH序列通过MEGA 6.0软件进行分析，以Gardeniajasminoides的psbA-trnH(JX 312218)的起始位置序列的5’-GAC GTT AGC CTT ATT GTA TAA GAG T-3’，共25 bp确定所有样本的起始点。psbA-trnH序列分析结果(表2)表明，10个栀子属植物psbA-trnH序列长度在250～297 bp的范围内，其中A平均101.4 bp，T 96.2 bp，C 22.9 bp，G 47.7 bp；A+C占比平均74%，G+C平均占比26%，可见栀子属样本的psbA-trnH序列中A+T的含量远高于G+C。如栀子属psbA-trnH 序列特征所显示，psbA-trnH 序列变异比较大的因素可能是低能量碱基所占份额大、无功能、自然选择压力小。通过MEGA 6.0排序后的间并序列长度为311 bp，变异位点如图3所示，共77个，占位点数24.76%；简约信息位点20个，占位点数6.43%。

图2 psbA-trnH片段琼脂糖凝胶电泳图

3.4 psbA-trnH序列遗传特征分析

采用Pair-wise distance(PW)法对10个栀子属样本的psbA-trnH序列计算遗传距离，结果如表3所示。10个栀子属样本的遗传距离波动在0.000～0.206，平均遗传距离为0.058。栽培栀子(LZ)与Gardeniathailandica(JX 312213)遗传距离为0.000，该结果与中药茜草遗传距离一致[18]，但通过变异位点分析(图3)，两者存在19个变异位点，在DNA分子的一级结构上可区分出两物种遗传差异，可见采用psbA-trnH序列片段一级结构能对栀子属物种做出细微鉴别；栽培栀子(LZ)、重瓣栀子(GZ)、雀舌栀子(QZ)这3个江西省品种与Gardeniasaxatilis(JX 312208)的遗传距离较大，平均为0.156，亲缘关系较远。

注：Identical=. Missing=? Indel=-。图3 10个栀子属植物psbA-trnH序列变异位点

图4 基于psbA-trnH序列的10个栀子属种间种系统发育树

表3 10个栀子属植物psbA-trnH序列的遗传距离

序号12345678910120．02430．0240．01940．0790．0690．06450．0290．0390．0480．07960．1520．1590．1580．2060．14170．0000．0240．0240．0790．0290．15280．0140．0290．0290．0630．0430．1520．01490．0050．0290．0290．0840．0330．1470．0050．019100．0050．0190．0190．0740．0340．1460．0050．0090．009

注：1为栽培栀子(LZ)，2为重瓣栀子(GZ)，3为雀舌栀子(QZ)，4为Gardeniasaxatilis(JX 312208)，5为Gardeniasootepensis(JX 312210)，6为Gardeniaobtusifolia(JX 312211)，7为Gardeniathailandica(JX 312213)，8为Gardeniacollinsae(JX 312214)，9为Gardeniataitensis(JX 312217)，10为Gardeniajasminoides(JX 312218)。

采用UPGMA法对10个栀子属样本的psbA-trnH序列构建系统发育树，如图4所示。从图4可见，栽培栀子(LZ)、Gardeniathailandica(JX 312213)、Gardeniataitensis(JX 312217)、Gardeniajasminoides(JX 312218)4个物种亲缘关系比较近，聚为一支；重瓣栀子(GZ)、雀舌栀子(QZ)的遗传关系更近，聚为一支；在10个样本中，Gardeniaobtusifolia(JX 312211)的亲缘关系与其他种较远。可见，psbA-trnH序列可用于栀子属植物的分子鉴定。

4 讨 论

随着分子标记技术的发展以及中药质量安全的要求，在中药鉴定研究中， DNA条形码技术的引入大大促进了中药植物鉴定的发展，并有多种药用植物应用DNA条形码技术来鉴别其真伪品和道地性[12]。目前，有多条DNA条形码候选序列成功地用于物种鉴别和系统分类，如rDNA ITS序列片段成功鉴别广东紫珠[13]、盘龙参[14]、钩藤[15]、黄草石斛[11]等物种，ITS 2条形码成功用于豆蔻属物种的系统分类[16]，rbcL序列片段在五味子[17]鉴定上取得了很好的成果。

为更好掌握栀子的遗传相似性，便于指导药材栀子的选育，本实验首先采用了rDNA ITS、matK、rbcL3个序列的DNA条形码通用引物对3个栀子样本进行PCR扩增，结果表明，matK、rbcL 2个片段PCR扩增未成功，rDNA ITS扩增成功并测序；matK序列因为引物特异性差，一般认为是PCR扩增成功率不高的DNA片段[9]，本实验matK序列通用引物进行样本PCR扩增，3个样本均未扩增成功；而扩增成功的rDNA ITS序列测序分析结果表明，重瓣栀子(GZ)、雀舌栀子(QZ)、栽培栀子(LZ)在rDNA ITS片段上序列高度一致，不能区分来源于江西宜春地区的3种栀子。

psbA基因是编码光合作用系统Ⅱ反应中心的D 1蛋白，trnH是编码tRNA组氨酸基因，两基因之间的序列称为psbA-trnH 间隔序列，其存在于叶绿体上，属于母性遗传。此段序列仅起到链接2个基因的作用，其所受到的选择压力小，存在相对较多的变异位点，进化速率快，两端DNA序列保守便于设计通用引物[18]，是被普遍看好的DNA条形码序列，尤其是对有花植物[8]，对物种的识别能力可高达90%[19]。本实验采用psbA-trnH序列的通用引物对3个栀子样本进行PCR扩增，均成功，并测序。序列分析结果表明，栀子属物种的psbA-trnH序列片段上，G+C含量远低于A+T 含量(74%)，这一结果与枫斗类石斛[11]、茜草[20]的psbA-trnH序列特征变化一致；对10个栀子属物种的psbA-trnH序列进行遗传结构和系统发育分析结果表明，该片段可作为栀子属物种鉴别的DNA 分子标记。

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Analysis and Identification of psbA-trnH Sequence of Gardenia Species

ZHANGBingfeng，ZHOUXiuling

(College of Chemistry and Biotechnology，Yichun University，Yichun Jiangxi 336000，China)

The study aimed to investigate the variation of psbA-trnH intergenic region sequences in Gardenia species.The DNA sequences of psbA-trnH were amplified,sequenced,and then analyzed by the software MEGA 6.0.The Genetic distances were calculated through using Pair-wise distance method,and molecular authentication analysis was constructed by Neighbor-joining (NJ) method.The results showed that the total lengths of psbA-trnH were 250-297 bp,the content of A+T was 74%,higher than that of G+C.The percentage of variation sites was 24.76% and parsimony informative sites up to 6.43%;the average genetic distances was 0.058;the phylogenetic tree demonstrated that all samples ofGardeniaspecies were identificated.Therefore,the psbA-trnH sequence was an efficient region for molecular identification ofGardeniaspecies.

Gardeniaspecies; psbA-trnH； molecular authentication; DNA barcoding

2016-10-22

教育部生物工程特色专业建设；江西省天然药物活性成分研究重点实验室开放基金项目。

张兵锋(1979—)，男，河南上蔡人；博士，主要从事药学研究；E-mail：jiaminligz@163.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.033

S 567.1+9

A

1001-4705(2017)03-0033-05