， ， ， ， ，

(1.安徽农业科学院， 合肥 230031； 2.贵州省中国科学院，天然产物化学重点实验室， 贵阳 550002；3.西安工程大学环境与化学工程学院， 陕西 西安 710048)

低温胁迫对燕麦种子萌发期蛋白质组影响的研究

王霞霞1，李龑2，李岩1，徐智明1，朱德建1，沈玲3

(1.安徽农业科学院， 合肥 230031； 2.贵州省中国科学院，天然产物化学重点实验室， 贵阳 550002；3.西安工程大学环境与化学工程学院， 陕西 西安 710048)

为探析燕麦种子萌发时蛋白质的差异表达及其相关蛋白的生理功能，采用室内生测法比较了不同温度下种子萌发力和幼苗的生长能力，同时采用双向电泳(2-DE)结合基质辅助激光解析飞行时间质谱的方法，比较低温条件下(5 ℃)吸胀25 h和128 h(萌发)与正常温度下吸胀25 h(萌发)时种子蛋白质组的差异表达。结果表明，随着温度的降低，燕麦种子的萌发活力降低。燕麦种子蛋白质组在低温胁迫下萌发时，有7个蛋白质点发生了变化，其中5 ℃低温吸胀25 h时，有3个蛋白质点的表达量降低；5 ℃低温吸胀萌发128 h时，有5个蛋白质点表达发生了改变，其中3个蛋白质点的表达量增加。经MALDI-TOF质谱鉴定分析和Mascot搜索NCBI非冗余数据库，确定了4个蛋白质，分别为燕麦蛋白、燕麦蛋白N 9和丝氨酸蛋白酶抑制剂等。这些蛋白质的质量变化与燕麦种子萌发时的低温胁迫可能有关联。

燕麦； 双向电泳； 质谱； 种子蛋白； 低温胁迫

seed protein; low temperature stress

燕麦属于冷凉区作物，多在早春和秋季播种，因此在早期生长中易遭遇低温伤害。燕麦种子萌动发芽后遭遇低温会使种子生长减缓甚至停止生长[1]。陈立君等研究认为，随着温度的降低和低温持续时间的延长，种子萌发率和出苗率均下降，且萌发和出苗时间延缓[2-3]。贾志国等还就遭遇低温胁迫时种子的某些生理特性作了分析[2,4]。

蛋白质差异表达是复杂的生命活动中生物体繁复的基因表达模式及多变的环境条件的综合体现。因此，从蛋白质组入手有助于更全面的了解低温胁迫的伤害机制和植物的适应机理。目前关于植物低温胁迫的蛋白质应答研究比较多。周瑞莲等研究发现，在一定的温度范围，成熟过程中大豆种子蛋白质的累积与温度的降低负相关[5]。孙勇等分析了香蕉幼叶低温胁迫下的蛋白表达谱，得到了82个有显著差异的蛋白点，差异蛋白分析表明，绿色组织通过改变光合作用、糖类及能量代谢相关酶的表达量来调节能量与碳代谢，保证养分供给，同时主要借助超氧化物歧化酶清除系统来提高抵御低温的能力[6]。这与黄锦文等[7]研究较为相似。沟叶结缕草叶片中胞内信号转导、活性氧的清除、蛋白质防御等代谢途径的相关蛋白在低温适应的过程中表达量有所增高[7]。Cui等[8]在低温胁迫的水稻叶片上发现了60多个蛋白质表达量发生了改变。这些研究为植物抗低温环境下生理活动的分子机制的解析提供了基础，但多集中于绿色组织。关于种子萌发时蛋白表达应答低温胁迫的报道较少。王霞霞等[9-10]对燕麦品种白燕2号种子的蛋白质组和种子萌发时蛋白质的差异表达作了分析，为了解燕麦籽粒的生理活动机制提供了基础资料。在此基础上，本试验仍以燕麦品种白燕2号为试材，于智能气候培养箱内不同温度下培养萌发，比较其萌发和早期幼苗的生长情况，选择具有代表性的处理进行萌发期种子蛋白质组表达的差异分析，从而构建燕麦种子应答低温胁迫的蛋白质差异表达图谱，为探析燕麦种子萌发时应答低温胁迫的机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料培养

本试验以栽培中较广泛的燕麦品种白燕2号种子为试材。试验共设4个恒温处理和2个变温处理：5，10，15，20 ℃，20 ℃(12 h)/12 ℃(12 h)、10 ℃(12 h)/2 ℃(12 h)，其中20 ℃处理为对照。

选用饱满一致的种子，经乙醇溶液(70%)消毒(5 min)后用蒸馏水清洗3次。按照20粒/皿将种子腹沟朝下均匀置于直径12 cm垫2层滤纸的培养皿，培养皿注入蒸馏水(10 mL)后于不同温度培养箱内培养至种子萌发后立即移入20 ℃恒温条件下培养生长。于萌发处理的第140小时测定幼苗的生长情况。每处理3次重复。

1.2 种子萌发力及早期幼苗生长的测定

以胚根突破种皮2 mm为准，统计萌发进程，同时参考文献[11]测量不同处理萌发种子茎高、根长、茎鲜重/干重及根鲜重/干重，并计算萌发率、萌发2 d时的萌发指数、萌发初始时间、萌发完成时间及贮藏物质转运率等参数。

1.3 蛋白质的分离与鉴定

1.3.1 蛋白样品制备

不同处理萌发期种子40粒，液氮中研磨成粉末状。种子粉末转入离心管，按种子粉末60 mg配比1 mL双向电泳裂解液(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、65 mmol/L二硫苏糖醇和0.5% IPG 缓冲液)混合，充分振荡后于低温4 ℃静置10 h，离心15 min(10 000 r/min)。上清液即为蛋白质样品。考马斯亮蓝法测定样品液蛋白质浓度后分装于离心管并低温(-80 ℃)冻存备用。

1.3.2 燕麦种子蛋白电泳分离和蛋白质点的鉴定

[11]的方法，二维凝胶电泳分离燕麦种子蛋白质，构建蛋白质二维图谱。以蛋白点染色密度变化幅度高于2倍为标准选择差异表达的蛋白质点。挖取差异表达蛋白点于离心管超纯水冲洗后加入50%乙氰和25 mmol/L的碳酸氢铵溶液冲洗，再于纯乙氰脱色过夜获得白色不透明的胶粒。胶粒干燥后于胰蛋白酶溶液中酶解过夜(37 ℃)；注入1%三氟乙酸终止反应后用ultraflex TOF-TOF质谱仪(Bruker，Germany)分析肽质量，并用Mascot搜索NCBI 非冗余蛋白质数据库[11]。

2 结果与分析

2.1 低温胁迫对燕麦种子萌发的影响

由表1可知，随着温度的降低，燕麦种子萌发率和萌发指数降低，萌发完成时间逐渐延长。5 ℃恒定低温处理下燕麦种子萌发率仅为对照的71%。种子萌发的发生时间大大推迟，萌发持续时间延长至对照的4.8倍之多。而间歇性的2 ℃低温处理的种子虽然也很大程度的延缓了萌发，但萌发率仍高达93.33%。

表1 温度对萌发期燕麦种子活力的影响

温度处理(℃)萌发初始时间(h)萌发完成时间(h)萌发率(%)萌发指数20(ck)19．00b32．00e100．00a22．83a1520．00b50．00d98．43a18．33b1048．00c70．00c95．00b12．17c5128．00a148．00a71．00c0．00d20(12h)/12(12h)18．00b29．00e94．80b18．50b10(12h)/2(12h)80．00a110．00b93．33b0．00d

注：字母表示plt;0.05。下同。

注：A为20 ℃吸胀25 h燕麦种子2-DE图； B为5 ℃吸胀25 h燕麦种子2-DE图；C为5 ℃吸胀128 h燕麦种子2-DE图。图1 不同温度下萌发燕麦种子2-DE蛋白质图谱

由此可见，燕麦种子萌发时可忍耐短暂的极低温度，而对长时间的低温较敏感。因此，本试验选择5 ℃低温处理的种子作为种子萌发期应答低温伤害研究的代表性处理。

2.2 低温胁迫对燕麦早期幼苗生长的影响

低温胁迫下萌发的种子在正常生长温度下幼苗的生长情况见表2。由表2可知，低温胁迫不仅抑制了种子的萌发进程，还对后期幼苗的生长有影响。随着温度的降低，幼苗的根长、茎长、种子贮藏物质的转运速率均降低。5 ℃低温处理幼苗的根/茎生长分别为对照的2.27%、4.1%，其贮藏物质转运率仅为对照的1.5%。而间歇性的2 ℃低温[10 ℃(12 h)/2 ℃(12 h)]处理的贮藏物质转运率为18.25%，是5 ℃恒定低温处理的的24.27倍。

表2 不同温度下处理萌发燕麦种子的幼苗生长

温度处理(℃)根长(cm)茎长(cm)贮藏物质转运率(%)20(ck)8．8a4．9a49．72021a156．7b4．4a35．90811b104．1c2．6b31．98327c50．2e0．2c0．753025e20(12h)/12(12h)2．8d2．5b38．85174b10(12h)/2(12h)3．1d2．2b18．24633d

2.3 低温胁迫对燕麦种子萌发蛋白质组的影响

一般而言，适温下燕麦种子20 ℃下吸胀萌发20 h左右种子即可进入生长吸水期(第3阶段)，胚根突破种皮，幼苗生长开始[10]。鉴于低温会延缓种子萌发，因此温度处理燕麦种子样品按照时间和种子萌发进程2个标准进行。结合本试验中燕麦萌发初始时间分别为19 h(20 ℃)和128 h(5 ℃)，分别于萌发处理25，138 h进入萌发盛期。因此，燕麦种子萌发应答低温胁迫的蛋白质研究对照样品采集20 ℃处理25 h(萌发盛期)的萌发种子；而低温处理样品采集则分别取5 ℃处理25 h未萌发种子和5 ℃处理138 h(萌发盛期)的萌发种子。

图1为正常温度(20 ℃)下已萌发(25 h)种子与5 ℃低温下处理25 h和已萌发(138 h)种子蛋白质组的2-DE凝胶图谱。凝胶经PDQuest 8.0.1软件分析。与对照(20 ℃)条件下燕麦种子蛋白质组相比，5 ℃低温下吸胀25 h时有3个蛋白质点的表达量发生了明显的下调(蛋白点1、2、3)；至5 ℃138 h时有4个蛋白质点表达发生了改变，其中3个蛋白质点的表达量增加(蛋白点5、6、7)。经质谱鉴定，仅4个蛋白质点得到有效鉴定，结果如表3所示。凝胶中分子质量相似而等电点不同的2个蛋白点2和6经质谱鉴定为同一种蛋白——燕麦蛋白。

3 讨 论

温度是影响种子萌发的主要条件之一。本试验对不同温度处理的燕麦种子萌发情况做了分析。结果发现，在2～20 ℃范围内，燕麦种子均可萌发，但是随着温度的降低，萌发率和萌发势降低。这一结果与杜尧东等[4]在番茄种子低温胁迫下萌发的研究结论相似。同时，随着萌发时温度的降低，早期燕麦幼苗的根长、茎长、种子贮藏物质的转运速率均降低。种子蛋白分析显示：低温使得燕麦种子的贮藏蛋白发生差异表达。虽然本试验显示燕麦种子萌发时甚至可耐间歇性2 ℃的低温，但是10 ℃(12 h)/2 ℃(12 h)处理的贮藏物质转运率仅为18.25%，仅及10 ℃恒定低温处理的57.07%。由此可见，低温对种子贮藏蛋白的动员利用严重的影响着燕麦早期幼苗的建成。其缘由可能是低温胁迫消耗了一定能量从而缩减了幼苗建成时的能量供给，也可能是低温胁迫下差异表达的蛋白阻碍了幼苗的建成。

表3 差异表达蛋白质点的质谱鉴定结果

蛋白质点登录号蛋白质名称序列等电点分子质量覆盖率(%)得分表达1gi：6692103丝氨酸蛋白酶抑制剂3F22C12．22K．KIDFVADHPFLFLIR．E；K．DFVADHPFLFLIR．E；R．EEKTGTVLFVEMEDEGAMK．K；R．QGNDTSRNFSMHFYLPDEK．D5．21729118128下调2gi：358247775燕麦蛋白AveninproteinR．QAICQVTR．Q；R．QLAQIPEQLR．C；R．QFLVQQCSPVAAVPFLR．S7．702457816110下调6gi：327315253燕麦蛋白AveninproteinR．QFLVQQCSPVAEVPFLR．S；R．QLAQIPEQVR．C7．722611612137上调7gi：75107166燕麦蛋白N9AveninN9R．QAICQVAR．Q；R．QLAQIPEQLR．C；R．QFLVQQCSPVAVVPFLR．S7．442147919128上调

植物在抵御逆境侵害的过程中自身将会发生一系列生理生化反应，并诱导某些基因特殊表达，进而使蛋白质的种类、数量或表达方式发生变化。目前，低温胁迫蛋白质组研究主要是以沟叶结缕草[7]、水稻[12-15]等植物绿色材料进行的。Hashimoto[16]比较了2周龄水稻叶片，叶鞘、根系经5 ℃低温胁迫2 d的蛋白质组的变化，结果发现：低温胁迫会引起植物体内产能代谢的活跃，从而使得与胁迫相关的蛋白质表达量上调，而与防御相关蛋白表达量下降；而且不同组织的蛋白质组对低温的响应表达有差异。Renaut等[17]报道低温胁迫下，杨树幼苗叶片中的热激蛋白、伴侣蛋白、脱水素和 LEA 等蛋白质的表达量上调，而与能量代谢相关的蛋白质表达量下调，甚至消失。Yang等[18]研究认为，种子萌发中类似驱动蛋白通过调节需氧呼吸抵抗低温胁迫。可见，植物对低温逆境胁迫的应答机理不仅受物种的影响，同时与作物组织器官、生育期等有关联。

本试验比较了5 ℃和20 ℃下萌发的燕麦种子的蛋白质组的表达。结果发现：低温胁迫下萌发时，燕麦种子中的燕麦蛋白、燕麦蛋白N 9和F 22 C 12.22等蛋白发生了差异表达。燕麦蛋白是燕麦种子萌发时动员利用的主要蛋白质类型[9]。王霞霞[10]在萌发的燕麦种子中曾检测到5个不同的燕麦蛋白。本试验发现，短时间(25 h)低温(5 ℃)处理不仅使得种子未能萌发，同时伴随着燕麦蛋白(gi:358247775)表达被抑制。随着低温处理时间延长至128 h种子萌发时，燕麦籽实贮藏蛋白中燕麦蛋白(gi:327315253)和燕麦蛋白N 9(gi:75107166)的表达量上调。燕麦蛋白(gi:327315253)在未萌发的燕麦种子中表达量较高，正常温度下萌发时其表达量有所降低[10]。然而本实验发现，低温胁迫使得此蛋白在萌发的燕麦种子中表达量增加。多形态、多方式的燕麦蛋白表达可能是燕麦蛋白在其种子萌发和逆境胁迫双重作用下发生了蛋白修饰、降解等过程所致的结果。

F 22 C 12.22表示丝氨酸蛋白酶抑制剂3，即serpin 3、SRP 3，是丝氨酸蛋白酶抑制剂(serpin)的一种。蛋白酶抑制剂(protease inhibitor,PI)与蛋白酶(protease)普遍存在于动植物及微生物中。它们以相互影响的动态平衡来实现生物调控的目的。蛋白酶抑制剂多存在于植物的贮藏器官，尤其是种子和球茎，其含量常常可高达总蛋白的1%～10%。植物叶片受机械损伤或化学处理也会大量积累蛋白酶抑制剂。目前已发现含有蛋白酶抑制剂的植物有90多种，多存在草本植物，包括豆科、禾本科、茄科等[20]。丝氨酸蛋白酶抑制剂多存在于种子、块茎等器官。它对植物本身具有保护作用。例如，可使种子处于休眠状态防止种子自身发生分解代谢。随着种子的萌发，种子的丝氨酸蛋白酶抑制剂的含量降低[22]。本试验发现，低温胁迫会抑制丝氨酸蛋白酶抑制剂在种子萌发中的表达。但是关于其在种子中涉及的相关生理功能还有待进一步的探讨。

参考文献：

[1]贾志国,张丽.低温胁迫对不同萌发状态的裸燕麦种子某些生理特性的影响[J].作物杂志,2011(5):117-118.

[2]陈立君,郭强,刘迎雪,等.不同温度对大豆种子萌发影响的研究[J].中国农学通报,2009,25(10):140-142.

[3]张献英,唐力生,犹昌艳,等.低温对豇豆种子萌发和出苗的影响[J].南方农业学报,2013,44(11):1 785-1 790.

[4]杜尧东,段世萍,陈新光,等.低温胁迫对番茄种子萌发的影响[J].生态学杂志,2010,29(6):1 109-1 113

[5]周瑞莲,王仲礼,侯月利，等.温度对大豆(Glycinemax)种子发育过程中蛋白质、脂肪和淀粉积累过程的影响[J].生态学报,2008,28(10):4 635-4 644.

[6]孙勇,王丹,全征,等.初香蕉幼苗叶片响应低温肋迫的比较蛋白质组学研究[J].中国农学通报，2015,31(34):216-228.

[7]黄锦文,林争春,陈冬梅,等.沟叶结缕草应答高温和低温胁迫的蛋白质表达差异分析[J].草地学报，2010,18(5):636-650.

[8]Cui Suxia,Huang Fang,Wang Jie,et al.A proteomic analysis of cold stress responses in rice seedlings[J].Proteomics,2005,5(12):3 162-3 172.

[9]王霞霞,曹坳程,柴守玺,等.基于双向电泳结合质谱分析燕麦种子萌发过程蛋白的变化[J].草地学报,2012,20(4):729-734.

[10]王霞霞,柴守玺,常磊,等.燕麦种子蛋白质组的GeLC-MS/MS分析[J].草地学报，2012,20(1):108-115.

[11]王霞霞,李龑,唐杰伟,等.盐胁迫对燕麦种子萌发期蛋白质组影响的研究[J].华北农学报,2015,30(3):48-53.

[12]Gammulla CG,Pascovici D,Atwell BJ,et al.Differential proteomic response of rice (Oryzasativa) leaves exposed to high- and low-temperature stress[J].Proteomics,2011,11(14):2 839-2 850.

[13]Kjellsen TD,Shiryaeva L,Schroder WP,et al.Proteomics of extreme freezing tolerance in Siberian spruce (Picea obovata)[J].J Proteomics,2010,73(5):965-975.

[14]Li Tian,Xu Shou-Ling,Oses-Prieto JA,et al.Proteomics analysis reveals post-translational mechanisms for cold-induced metabolic changes in Arabidopsis[J].Mol Plant,2011,4(2):361-374.

[15]Wong JH,Cai N,Tanaka CK,et al.Thioredoxin reduction alters the solubility of proteins of wheat starchy endosperm:an early event in cereal germination[J].Plant and cell physiology,2004,45(4):407-415.

[16]Hashimoto M,Komatsu S.Proteomic analysis of rice seedlings during cold stress[J].Proteomics,2007,7(8):1 293-1 302.

[17]Renaut J,Lutts S,Hoffmann L,et al.Responses of poplar to chilling temperatures: proteomic and physiological aspects[J].Plant Biology (Stuttgart,Germany),2004,6(1):81-90.

[18]Yang Xue-Yong,Chen Zi-Wei,Xu Tao,et al.Arabidopsis kinesin KP1 specifically interacts with VDAC 3,a mitochondrial protein,and regulates respiration during seed germination at low temperature[J].Plant Cell,2011,23(3):1 093-1 106.

[19]Chesnut R S,Shotwell M A,Boyer S K,et al.Analysis of avenin proteins and the expression of their mRNAs in developing oat seeds[J].Plant C'e11,1989,1(9):913-924.

[20]刘会香,张星耀.植物蛋白酶抑制剂及其在林木抗虫基因工程中的应用[J].林业科学,2005,41(3):150-157.

[21]Davie EW,Fujikawa K,Legaz ME,Kato H.Role of proteases in blood coagulation,in proteases and biological control,ed.by Reich E.et al,Vol.2 of Cold Spring Harbor Conference on Cell Proliferation,1975.

[22]孙冰,郑留学,朱思齐,等.大豆发芽过程中异黄酮、维生素C、胰蛋白酶抑制剂含量变化的研究[J].食品工业科技,2013,24(34):147-149.

Analysis of Protein Changes During Oat Seed GerminationUnder Low Temperature Stress

WANGXiaxia1，LIYan2，LIYan1，XUZhiming1，ZHUDejian1，SHENLing3

(1.Anhui Academy of Agricultural Sciences，Hefei 230031，China；2.The Key Laboratory of Chemistry for Natural Products of Guizhou Province and Chinese Academy of Sciences,Guiyang 550002,China;3.School of Environmental and Chemical Engineering,Xi’an Polytechnic University,Xi’an Shanxi 710048,China)

To analysis the differences of protein expression and its related physiological function of oat seed germination under salt stress,the seed germination rate and seedling growth were compared at different low temperature,and the changes of oat proteins were investigated during the seed germination at the low temperature.Two-dimensional gel electrophoresis was applied to analyze the changes of seeds proteins at 25 h after imbibition at 20 ℃,seeds proteins at 25 h and 138 h after imbibition at 5 ℃.The results showed:seed germination of oat and growth of seedlings were decreased.The changes of protein were detected and seven protein spots were altered.three protein spots were decreased at 25 h after imbibition at 5 ℃,and five spots were altered at 138 h after imbibition in 5 ℃.These spots were identified using MALDI-TOF mass spectrometery and searching NCBI database with Mascot software.Four proteins was identified including SRP 3,avenin protein and avenin N 9.Those differential proteins expression are linked with oat seed germination under low temperature stress.

AvenasativaL.; two-dimensional gel electrophoresis; mass spectrometery;

2016-10-13

安徽省农业科学院创新项目(15 B 0411)。

王霞霞(1977-)，女，甘肃庆阳人；博士，主要从事作物生态生理的研究；E-mail:wangxiaxia1029@sina.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2017.03.028

S 512.6

A

1001-4705(2017)03-0028-05