窄谱中波紫外线诱导人永生化表皮细胞凋亡的Wnt /β-catenin信号通路机制研究

2017-11-29惠海英张美芳肖生祥

实用皮肤病学杂志 2017年5期

惠海英，吴娜，张美芳，肖生祥

惠海英，吴娜，张美芳，肖生祥

目的探讨窄谱中波紫外线（NB-UVB）通过Wnt /β-catenin信号通路对人永生化表皮细胞（HaCaT cells）的增殖及凋亡影响。方法研究对象为人HaCaT细胞系，实验分为空白对照组、NB-UVB组、BIO组、NB-UVB+BIO组。四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察细胞增殖能力；流式细胞仪（FCM）实验检测细胞凋亡；实时定量聚合酶链反应（PCR）、Western-blot检测细胞内的β-catenin、survivin、caspase-3表达水平。结果与正常对照组相比，NB-UVB组细胞增殖抑制作用及凋亡明显增强（P＜0.05），同时观察到NB-UVB组β-catenin及survivin表达降低，caspase-3表达增强（P＜0.05）。而NB-UVB+BIO组明显减弱了NB-UVB对HaCaT细胞的这些作用（P＜0.05）。结论NB-UVB可能通过下调Wnt /β-catenin信号通路、抑制HaCaT细胞的增殖及促进凋亡。

中波紫外线，窄谱；HaCaT细胞；Wnt /β-catenin

近年来，紫外线对人体的损伤已引起人们的广泛关注。资料表明，日光中的紫外线特别是中波紫外线（UVB）与皮肤的光老化、光损伤和光致癌的发生密切相关，严重威胁着人类的身体健康[1,2]。皮肤光老化在临床上主要表现为皮肤粗糙、弹性丧失、出现粗深皱纹、色素沉着斑、毛细血管扩张或减少、良性甚至恶性肿瘤。紫外线辐射导致的皮肤光老化的机制涉及众多信号分子和多条细胞信号转导通路，但其UVB诱导人皮肤光老化的机制尚不明确。本研究通过UVB诱导人永生化表皮细胞（HaCaT cells）损伤，建立UVB损伤皮肤细胞模型,选取凋亡蛋白caspase-3及凋亡抑制蛋白survivin,探讨了NB-UVB通过Wnt/β-catenin信号通路对皮肤HaCaT细胞凋亡及相关蛋白的影响，以期深入研究UVB 辐射损伤的机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞和试剂人永生化HaCaT细胞株为第四军医大学西京医院皮肤科李承新教授馈赠。改良的DMEM培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（美国Gibco公司），噻唑兰（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）（美国sigma公司）。Annexin V-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒（美国BD公司）。survivin、caspase-3兔多克隆抗体和β-catenin以及相应的二级抗体（美国SANTA公司）。RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒（日本Takara公司）。GSK-3抑制剂BIO（美国sigma公司）。聚合酶链反应（PCR）引物由上海华大生物工程技术服务有限公司合成。

1.1.2 仪器电泳仪（美国Bio-RAD公司）、酶标仪（美国Bio-Tek公司）、电转槽（美国Bio-RAD公司）、流式细胞仪（美国BD-FACScalibur）、FluorChem FC2凝胶成像分析系统（美国Alpha Innotech公司）、7500型实时定量PCR检测仪（美国 ABI公司）。SS-03B 型光疗仪（上海sigma公司，波长311nm）。

1.2 方法

1.2.1 细胞株培养 HaCaT细胞株常规方法复苏后，用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素的DMEM低糖培养基，置5%CO2培养箱（37℃，相对湿度95%）培养，2～3 d传代1次，取对数生长期细胞制成4×104单细胞悬液，接种于6孔板后继续培养 24 h给药。

1.2.2 NB-UVB照射及分组待细胞生长至每孔融合 80%～90%时，吸去培养基, 加入2 ml phosphate buffer solution（PBS）缓冲液, 细胞暴露于NB-UVB灯管下, 照射距离约为10 cm，给予75 mJ/cm2辐射剂量照射（使用紫外线辐照度监视计检测紫外线光疗仪辐照强度，以保证照射剂量精确）。紫外线照射后吸去PBS，并在各孔中重新加入培养液继续常规培养24 h进行后续实验。实验分为4组，空白对照组、NB-UVB组、BIO组、NB-UVB+BIO组。

1.2.3 MTT法检测HaCaT细胞增殖率取对数生长期细胞，0.25%胰酶消化，调整细胞数为4.0×104/ml，以每孔100 μl接种于96孔培养板，培养24 h后去原培养液进行实验。实验组及空白对照组各100 μl，每个浓度设3个复孔，于37℃、5%CO2条件下培养。培养结束前4 h，每孔加入MTT（5 ng/ml）20 μl。培养结束时，弃上清，加入DMSO 150 μl，振荡10 min，使结晶物充分溶解，用酶标仪测定吸光度（A570值），细胞抑制率=（1-实验组平均A值/空白对照组平均A值）×100%。

1.2.4 流式细胞仪Annexin V/PI检测HaCaT细胞早期及中晚期总凋亡率 HaCaT细胞经NB-UVB照射后24 h，经0.25% Trypsin-EDTA 消化，200 g离心 6 min，培养液弃去，磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次，收集的细胞经70%的乙醇 4℃固定 2 h，14 000 g 离心 2 min，固定液弃去，PBS 缓冲液（含 5 mmol/L EDTA）500 μl进行细胞重悬，再经RNA酶室温孵育 30 min，以1×binding buffer制成单细胞悬液，置于流式管，每组设6个样，加Annexin V-FITC 10 μl与PI 5 μl，混匀后室温下避光孵育15 min，再加入1×binding buffer充分混合后于流式细胞仪上检测细胞凋亡情况。

1.2.5 实时定量PCR检测HaCaT细胞β-catenin、caspase-3、survivin mRNA表达 HaCaT细胞经NBUVB照射后24 h，吸去培养液，经0.25%胰蛋白酶液分别制成细胞悬液，分别装入离心管，1 500 r/min离心，收集细胞，利用TaKaRa细胞总RNA抽提试剂盒提取各组细胞总RNA，采用TaKaRa反转录试剂盒按照说明书以RNA为模板反转录为cDNA，采用荧光定量PCR试剂盒按照说明书以cDNA为模板进行PCR反应，然后使用ABI7500 PCR仪进行荧光PCR。引物由上海华大生物公司合成，序列见表1。实时定量PCR反应条件：94℃预变性3 min，扩增40个循环，每循环中，94℃变性30 s，57℃退火30 s ，72℃延伸45 s，采集荧光信号；40循环结束后，经94℃30 s、57℃ 30 s、72℃45 s，采集熔解曲线。使用7500型Real-time PCR仪分析软件进行数据分析。以β-actin为内参基因，计算同一样本中目的基因与内参基因的含量比值，评价目的基因的表达水平。每个样本取3个复孔，PCR重复3次。

表1 引物序列

1.2.6 Western-blot检测细胞β-catenin、caspase-3、survivin 蛋白表达 UVB照射后的HaCaT细胞经胰蛋白酶消化法传代，加入1 μmol/L BIO工作液培养48 h。Western blot检测β-catenin、Caspase-3、survin蛋白表达水平，β-肌动蛋白作为内参蛋白，按照如下步骤进行操作：进行处理后细胞收集，4℃预冷PBS 液洗 3 次，加入细胞匀浆液（50 mmol/L This-HCl，pH=7.4，1%Triton X-100，0.2 mmol/L PMSF，1 mmol/L ED-TA），4℃、12 000 r/min 条件下离心 10 min，吸取上清，收集蛋白，收集细胞后用SDS上样缓冲液处理，检测总蛋白浓度。10%聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，上样量（30 μg），湿转NC膜，用50 g/L脱脂牛奶室温封闭30 min，不同浓度稀释一抗 β-catenin、caspase-3、 survivin孵育，4℃过夜，HRP 标记抗兔 IgG 二抗常温孵育 1 h，TBST洗膜，化学发光试剂显色、扫描并进行吸光度分析、计算蛋白相对表达水平。

1.3 统计学方法

采用统计软件SPSS19.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 NB-UVB照射对HaCaT 细胞增殖抑制的影响

MTT实验表明，与空白对照组相比，NB-UVB组细胞生长受到明显抑制（t=10.91，P＜0.05），但是与NB-UVB组相比，NB-UVB+BIO组的细胞生长抑制率明显降低（t=7.82，P＜0.05），说明BIO显著逆转了NB-UVB诱导的细胞抑制（图1）。

图1 不同处理组的细胞生长抑制率

2.2 NB-UVB照射对HaCaT细胞凋亡率的影响

细胞处理24 h后，进行流式细胞术检测，发现与正常对照组相比，NB-UVB组中晚期细胞凋亡率明显增加（t=13.23，P ＜0.05），但与NB-UVB组比较，NB-UVB+BIO组的细胞凋亡百分率降低（t=10.15，P ＜0.05），说明BIO可以明显减少NB-UVB所致的细胞凋亡。

2.3 NB-UVB照射对HaCaT 细胞β-catenin、caspase-3、survivin mRNA表达的影响

细胞处理24 h后进行检测，发现与正常对照组相比，NB-UVB组β-catenin mRNA表达明显降低（t=8.46，P＜0.05），NB-UVB+BIO组和BIO组轻度增高，但无统计学意义（P＞0.05）。但与NBUVB组比较，NB-UVB+BIO组及BIO组的β-catenin mRNA表达明显增加（tNB-UVB=5.36，tBIO=5.79，P＜0.05）（图2）。与正常对照组相比，NB-UVB组细胞caspase-3mRNA表达增加、survivin mRNA表达降低均较明显（tcaspase-3=14.26，tsurvivin=11.54，P＜0.05），同时与NB-UVB组比较，NB-UVB+BIO组及BIO组caspase-3mRNA表达降低（tNB-UVB=8.16，tBIO=7.24，P＜0.05），survivin mRNA表达增加（tNB-UVB=8.32，tBIO=8.58，P＜0.05）（图3）。

图2 不同处理组β-catenin mRNA表达

图3 不同处理组caspase-3、survivin mRNA表达

2.4 NB-UVB照射对HaCaT 细胞β-catenin、caspase-3、survivin 蛋白表达的影响

细胞处理24 h后进行检测，发现与正常对照组相比，NB-UVB组β-catenin 蛋白及survivin 蛋白表达降低，caspase-3蛋白表达增强。而NB-UVB+BIO组明显减弱了DHA对HaCaT细胞的这一作用（图4）。

图4 不同处理组β-catenin、 caspase-3、survivin蛋白表达电泳图

3 讨论

皮肤衰老分为内源性老化和外源性老化。外源性老化又称为光老化，主要由太阳中的紫外线辐射引起。近年来，由于臭氧层的破坏、过度日光浴等使人体暴露部位的皮肤衰老80%以上属于光老化[3]，皮肤光老化与皮肤细胞凋亡关系密切。

caspase 是执行凋亡的主要酶类，被称为死亡蛋白酶，是细胞凋亡的中枢效应器，细胞凋亡后期的共同途径由caspase 激活[4]。caspase蛋白酶家族在细胞凋亡中的一个重要作用是使保护细胞远离凋亡的各种蛋白失活。caspase-3处于caspase蛋白酶系的核心地位，在caspase酶系级联反应中发挥着重要作用。caspase-3 可能是整个凋亡级联反应的中心环节之一，在几乎所有的凋亡中被最后活化的 caspase分子，被认为是凋亡的最终效应蛋白。UVB 辐射后产生的ROS 可促进细胞凋亡，增加细胞内钙离子（Ca2+），降低线粒体膜电位，caspase-3蛋白[5]，最终引起细胞凋亡。

survivin是新近发现的凋亡抑制蛋白(IAP)家族中新的一员，于1997 年被 Ambrosinin 在人类基因组库的杂交筛选分离出来，是到目前为止所发现的最强的凋亡抑制因子[6]。survivin具有调控细胞周期和细胞凋亡的双重功能。survivin广泛表达于人的胚胎组织和各种肿瘤组织,也表达于少数正常成人组织,包括人的皮肤组织。在人类皮肤KSCs及黑素细胞、成纤维细胞均有表达。在维持人类角质形成细胞细胞周期变化及细胞增殖中起很重要的作用[7]。Survivin通过抑制其caspase-3、caspase-7活性而抑制细胞凋亡[8]。

Wnt信号是普遍存在于动物细胞内一条与生长发育及某些疾病的发生发展密切相关的信号途径。β-catenin是Wnt信号通路中关键的信号枢纽，可以存在于细胞膜、细胞质和细胞核内的胞质蛋白[9]。当Wnt信号异常激活，β-catenin蛋白不能被降解，导致β-catenin在胞质中聚集，并迁移至细胞核中，与Tcf4结合形成转录复合物，启动通路下游靶基因的转录，调节细胞的生长[10]。大量证据表明，Wnt /β-catenin信号通路可调控皮肤、毛发及其他附属器生长，是一种复杂的蛋白网络[11]。

BIO化学名为6-bromoindirubin-3'-oxime，是具有细胞通透性的小分子吲哚类化合物，其作用的发挥是通过激活胚胎干细胞内的 Wnt 信号途径而实现的。BIO为Wnt激活剂，为了确定NB-UVB是否对Wnt信号通路有失活作用，从而明确NB-UVB诱导HaCaT细胞凋亡的机制。笔者采用生物小分子Wnt激活剂BIO进行研究，结果表明，NB-UVB可引起HaCaT细胞抑制，BIO可显著逆转NB-UVB诱导的细胞抑制，同时NB-UVB能有效降低HaCaT细胞β-catenin总蛋白水平的表达，而BIO能过度表达β-catenin，可以减弱NB-UVB对HaCaT的生长抑制作用。同时也观察到NB-UVB可以下调survivin水平以及上调caspase-3的表达。而BIO明显减弱了NB-UVB对HaCaT细胞的这一作用。

上述数据表明，NB-UVB对HaCaT细胞增殖的抑制作用可能与Wnt /β-catenin信号失活，以及caspase-3及survivin有关，它们共同参与了皮肤的光损伤作用。

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NB-UVB regulation of HaCaT cells proliferation and apoptosis through Wnt/β-catenin signaling pathway: an experimental study

HUI Hai-ying，WU Na，ZHANG Mei-fang，et al
Department of Dermatology, Shaanxi Provincial People’s Hospital, Xi’an 710068, China

Objective To investigate the effects of narrow band ultraviolet B(NB-UVB) regulation of HaCaT cells proliferation and apoptosis through Wnt/β-catenin signaling pathway. Methods Human HaCaT cell lines was adopted as the experimental subject and divided into four groups(blank control group, NB-UVB group, NB-UVB+BIO group, BIO group). Four methyl thiazolyl tetrazolium(MTT) assay was used to observe the cell proliferative capacity, flow cytometry(FCM) test was used to detect cell apoptosis, real-time quantitative PCR and Western-blotting were used to detect the expression levels of intracellular β-catenin,antiapoptotic gene survivin and proapoptotic gene caspease-3. Results Compared with the control group, the proliferation and viability of HaCaT cells were inhibited and cell apoptosis was induced in NB-UVB group, meanwhile decreased survivin expression and increased caspase-3 expression of HaCaT cells were also observed in NB-UVB group. Furthermore, these effects were found to be depend on the suppression of Wnt/β-catenin signaling pathway as pretreatment with the Wnt activator BIO markedly dampened the DHA-induced effects. Conclusion NB-UVB may inhibit skin HaCaT cells by suppressing Wnt/β-catenin signaling pathway.

NB-UVB；HaCaT cells；Wnt/β-catenin[J Pract Dermatol, 2017, 10(5):267-270]