陈燕玲，罗 婷，吴秀香，曾洪敏，李海洲，康 毅，庄晓东，凡 栋，王晓玲，黄霜枝

(1.遵义医学院珠海校区 病理生理学教研室，广东 珠海 519041； 2.中山大学附属第一医院 心血管内科，广东 广州 510080)

丙酮醛对人肾近端小管上皮细胞损伤的作用及机制

陈燕玲1，罗 婷1，吴秀香1，曾洪敏1，李海洲1，康 毅1，庄晓东2，凡 栋1，王晓玲1，黄霜枝1

(1.遵义医学院珠海校区 病理生理学教研室，广东 珠海 519041； 2.中山大学附属第一医院 心血管内科，广东 广州 510080)

目的探讨丙酮醛对人肾近端小管上皮细胞(HK-2细胞)损伤的作用及可能机制。方法采用不同浓度的丙酮醛(100、200、400、800、1 600 μmol/L)处理HK-2细胞24 h后，应用CCK-8法检测HK-2细胞的存活率；罗丹明123染色法检测细胞线粒体膜电位；DAPI染色法观察HK-2细胞凋亡形态学变化。Western blot法检测HK-2细胞内磷酸化ERK1/2(phosphated ERK1/2,p-ERK1/2) 、Bax及cleaved- caspase-3蛋白表达水平。结果与对照组相比，不同的浓度的丙酮醛均能降低HK-2细胞存活率(Plt;0.01)；且HK-2细胞经丙酮醛诱导后cleaved-caspase-3(Plt;0.01)、Bax及p-ERK1/2蛋白表达水平均明显增高(Plt;0.05)。结论丙酮醛能诱导HK-2细胞出现明显的损伤及凋亡，其机制可能与其激活ERK1/2信号通路有关。

丙酮醛；凋亡；HK-2细胞；ERK1/2

糖尿病患者若血糖控制不理想，可导致多种并发症出现，其中最常见的慢性并发症为糖尿病肾病(Diabetic Nephropathy,DN)[1]。DN主要表现为高血压、蛋白尿和肾功能不全[2]。糖尿病肾病涉及多种复杂的发病机制，包括糖脂代谢异常、肾脏血流动力学改变、炎症物质及细胞因子的异常表达[3]。近年来，从糖代谢紊乱(糖基化终末产物的形成)角度探讨糖尿病肾病的发病机制越来越受到研究者的青睐[4]。丙酮醛(methylglyoxal,MG)作为糖基化终末产物的前体[5]，是一种高活性的α-二羰基化合物，在糖尿病时明显升高，与多种糖尿病相关的组织细胞损伤密切相关，是糖尿病并发症发生的关键环节[6-7]。因此，本研究选用MG来观察其对HK-2细胞的直接影响，探讨糖尿病肾病时肾脏损伤的可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞 HK-2细胞由中山大学中山医学院王蔚东教授馈赠。

1.1.2 药品与试剂 细胞培养相关试剂(胎牛血清、DMEM/F12培养基等)均购自Gibco；MG购自上海源叶生物科技有限公司，CCK-8细胞活力检测试剂盒购于同田生物有限公司；DAPI购自Sigma；p-ERK1/2抗体、Bax抗体、cleaved- caspase-3抗体及GAPDH抗体均购自Cell Signaling Technology(CST)；BCA蛋白浓度检测试剂盒购自 Thermo Scientific Pierce。

1.1.3 主要仪器 蛋白电泳仪，Bio-Rad公司(型号：Mini-PROTEAN Tetra)；荧光显微镜，OLYMPUS公司(型号：IX71)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及实验分组 在DMEM/F12培养基中加入10%胎牛血清配置HK-2细胞完全培养基，将HK-2细胞放在37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每隔2天进行细胞传代，取生长状态良好的HK-2细胞进行后续实验。实验分为control组及MG不同浓度处理组(100、200、400、800、1 600 μmol/L)。

1.2.2 MG对HK-2细胞存活率的影响 取生长状态良好的细胞，用胰酶消化，然后接种于96孔板，每孔加入100 μL 密度为2×108个/L的细胞悬液，每组设5个复孔。在显微镜下观察细胞长到约85%时，按照实验分组培养细胞24 h后，弃上清，用无血清培养基洗一次，然后每孔加入含10% CCK-8的无血清培养基100 μL，于37℃孵育1.5 h，酶标仪测定450 nm处吸光度值(OD值)，按照以下公式计算细胞存活率：细胞存活率(%)=(处理组OD值-空白孔OD值)/(对照组OD值-空白孔OD值)×100%。以上实验重复3次。

1.2.3 HK-2细胞内线粒体膜电位(MMP)的检测 HK-2细胞按3×107个/L的细胞密度均匀接种于6孔培养板内，按照实验分组培养细胞24 h后，弃培养基，PBS洗2遍，然后每孔加入1 mL终浓度为100 μg/L的罗丹明123,37 ℃恒温孵育20～30 min，在荧光显微镜下观察并随机选取8个不重复视野进行拍照。

1.2.4 DAPI染色法检测HK-2细胞凋亡 HK-2细胞按3×107个/L的细胞密度接种于6孔板后，按照实验分组培养细胞24h后，弃培养基，PBS洗2遍，加入4%多聚甲醛固定10min，PBS漂洗后，加入1μg/L DAPI试剂，室温避光孵育10 min后，弃染色液，每孔加入1mL PBS洗涤3次，每次5～10 min。然后在荧光显微镜下随机选取10个不重复视野进行拍照。正常细胞胞核呈现均匀的低密度蓝色荧光，而凋亡细胞胞核呈致密浓染或呈碎块状致密浓染。

1.2.5 Western blot 法检测凋亡相关蛋白(Bax及cleaved-caspase-3)和p-ERK1/2蛋白水平 HK-2细胞以2×106/L的密度接种于直径为60 mm培养皿中，当细胞生长至培养皿面积约85%时，按照实验分组培养细胞24 h后，弃培养基用预冷的PBS洗3次，加入RIPA细胞裂解液，冰上裂解20 min，然后用细胞刮把蛋白刮下来，13 255 g离心10 min后取上清，采用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度。每组蛋白上样量为50 μg，电泳：恒压80 V 30 min，100 V 70 min。电转：恒流 220 mA 1.5 h。PVDF膜用5%脱脂牛奶溶液室温封闭1 h，随后分别加入Bax、cleaved-caspase-3和p-ERK1/2抗体(I抗滴度均为1∶1 000)，4 ℃摇床孵育过夜。I抗孵育完毕后，加入Ⅱ抗孵育1 h(Ⅱ抗稀释倍数为1∶2 000)，然后用TBST洗3次，每次5 min。在暗室经曝光、显影及定影后，胶片上目的条带的灰度值使用ImageJ软件进行分析。

2 结果

2.1 MG可明显降低HK-2细胞存活率 用不同浓度的MG(100、200、400、800、1 600 μmol/L)处理HK-2细胞24 h后，CCK-8法检测细胞活力。如图1所示，与control组相比，不同浓度的MG均可以降低HK-2细胞细胞活力(Plt;0.01)，当MG浓度达到800 μmol/L时，细胞活力约只有control组的40%。

2.2 MG对HK-2细胞凋亡的影响 HK-2细胞经不同浓度的MG(100、200、400、800、1 600 μmol/L)处理24 h后，采用DAPI核染色法检测HK-2细胞凋亡情况。正常的HK-2细胞胞核呈现均匀的低密度蓝色荧光。如图2所示，未经处理MG处理的control组细胞胞核呈圆形，并显示均匀的蓝色低密度荧光。而使用MG处理后，部分细胞胞核出现核固缩或核分裂等典型凋亡特征，说明HK-2细胞经MG诱导后发生明显凋亡。

**：与control组相比图1 不同浓度的MG对HK-2细胞细胞活力的影响

白色箭头所指为发生凋亡的细胞。图2 MG对HK-2细胞凋亡的影响(200×)

2.3 MG对HK-2细胞线粒体膜电位的影响 用不同浓度的MG处理HK-2细胞24 h后，采用罗丹明123检测细胞线粒体膜电位。罗丹明123是一种可以显示线粒体跨膜电位高低的荧光染料，被广泛用于线粒体膜电位的检测。细胞加入罗丹明123孵育后会发出黄绿色荧光，荧光强度越强，代表细胞线粒体膜电位越高，细胞状态越好，反之，荧光强度越低，则线粒体膜电位越低。如图3所示，在荧光显微镜下观察，control组细胞可见较强的黄绿色荧光，而不同浓度的MG处理组，荧光强度均较control组明显降低，说明MG可以降低HK-2细胞线粒体膜电位。

2.4 MG对HK-2细胞Bax蛋白表达的影响 HK-2细胞经不同浓度的MG(100、200、400、800、1 600 μmol/L)处理24 h后，采用Western blot法检测细胞Bax蛋白表达水平。如图4所示，control组的Bax蛋白也有基础量的表达，而加入不同浓度MG处理后，Bax蛋白表达水平明显增高(Plt;0.05)，说明MG可以诱导Bax蛋白表达。

图3 MG对HK-2细胞线粒体膜电位的影响(200×)

*：与control组相比图4 MG对HK-2细胞Bax蛋白表达的影响

2.5 MG对HK-2细胞cleaved-caspase-3蛋白表达的影响 如图5所示，control组仅有少量cleaved-caspase-3蛋白表达，而经不同浓度的MG处理后，cleaved-caspase-3蛋白的表达水平均明显增高(Plt;0.01)。

2.6 MG对HK-2细胞p-ERK1/2蛋白表达的影响 如图6所示，control组HK-2细胞仅有少量的p-ERK1/2蛋白表达，而经不同浓度的MG处理后，p-ERK1/2蛋白表达水平明显增加(Plt;0.05)，表达量约为control组的1.5倍，说明MG可以激活ERK1/2信号通路。

**：与control组相比，Plt;0.01；*：与control组相比 图5 MG对HK-2细胞cleaved-caspase-3蛋白表达的影响

**：与control组相比，Plt;0.01；*：与control组相比图6 MG对HK-2细胞p-ERK1/2蛋白表达的影响

3 讨论

研究报道，糖基化终产物(advanced glycation end products,AGEs)可上调HK-2细胞ROS的水平及TGF-β mRNA及蛋白表达，促进糖尿病肾病的发生、发展[8]。MG作为AGEs的前体，具有快速生成AGEs的生物特性，是糖尿病组织细胞损伤的核心环节[9]。正常人体内MG水平很低，而糖尿病患者体内含量明显增高，1型糖尿病患者血清MG水平甚至可高达40.0μg/dL[10]。以往的研究认为糖尿病肾病的主要发病机制是肾小球损伤，所以关于MG的研究多数是与肾系膜细胞有关，对HK-2细胞影响研究甚少。而近年来研究发现，在糖尿病肾病中肾小管损伤可能早于肾小球损伤，且肾小管损伤在早期糖尿病肾病的形成中具有重要作用[11]。因此，研究MG对HK-2细胞的作用具有重要意义，可以为糖尿病肾病的发病机制提供实验依据。本研究结果显示，加入MG处理以后，HK-2细胞的存活率明显降低，而凋亡细胞数明显增加。提示MG对HK-2细胞具有毒性作用，可以诱导HK-2细胞发生明显损伤及凋亡。

经典的凋亡通路有2条，包括表面死亡受体通路和线粒体介导的内源性凋亡通路。由线粒体介导的凋亡通路是哺乳类动物发生凋亡的主要途径。细胞在受到凋亡信号刺激时，可引起线粒体通透性增高，跨膜电位(ΔΨm)被驱散，最终导致细胞凋亡的发生。在凋亡的发生中，还有两大家族的参与：Bcl-2家族及caspase家族。Bcl-2家族分为抑制凋亡和促进凋亡蛋白两大类。多种因素可以影响Bax和Bcl-2蛋白的表达，下调Bcl-2或上调Bax可以促进细胞凋亡。Caspase家族在凋亡中也具有重要作用，其中caspase-3是其家族中最重要的效应性蛋白裂解酶。正常情况下，在细胞质中的caspase-3是以酶原的形式存在的，当细胞接受凋亡刺激时，caspase-3被剪切成cleaved-caspase-3从而被激活，活化的caspase-3分子可以催化裂解众多的效应分子，最终诱发细胞凋亡[12]。本研究显示，HK-2细胞经MG处理后，线粒体膜电位明显降低，而Bax及cleaved-caspase-3蛋白表达水平明显增高，说明MG可能通过线粒体介导的内源性凋亡通路诱发细胞凋亡的。

MAPK是一丝/苏氨酸蛋白激酶家族，由ERK1/2、P38及JNK组成。其中ERK1/2是MAPK中的重要成员，与细胞凋亡有密切关系，其活性状态取决于磷酸化水平[13-15]。研究报道，MG通过激活p38及JNK通路介导肾系膜细胞及心肌细胞损伤，说明MG造成细胞的损伤与MAPK通路密切相关[16-17]。本研究显示，加入MG处理HK-2细胞24 h后，细胞内p-ERK1/2蛋白表达水平均比对照组增高，提示MG对HK-2细胞的损伤作用可能与其激活ERK1/2信号通路有关。

综上所述，MG可以诱导HK-2细胞发生凋亡，该作用与其降低细胞线粒体膜电位，增加Bax、cleaved-caspase-3蛋白表达及激活ERK1/2信号通路有关。因此，我们认为糖尿病肾病中肾小管损伤可能与MG有关。

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[收稿2017-04-27;修回2017-06-28]

(编辑：谭秀荣)

临床医学研究

Effectsofmethylglyoxalontheinjuryofhumantubuleepithelialcellsanditsmechanisms

ChenYanling1,LuoTing1,WuXiuxiang1,ZengHongmin1,LiHaizhou1,KangYi1,ZhuangXiaodong2,FanDong1,WangXiaoling1,HuangShuangzhi1

(1.Department of Pathophysiology,Zhuhai Campus of Zunyi Medical University,Zhuhai Guangdong 519041,China; 2.Department of Cardiovasology,the First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University,Guangzhou Guangdong 510080,China )

ObjectiveTo investigate the effects of different concentrations of methylglyoxal on the injury of human tubule epithelial cells (HK-2 cells) and its mechanisms.MethodsHK-2 cells were incubated with different concentrations of methylglyoxal (100,200,400,800 and 1 600 μmol/L) for 24 h.Cell viability was evaluated by CCK-8 assay.Mitochondrial membrane potential was detected by rhodamine-123.The morphological changes in apoptotic cells were measured by DAPI.The expression of cleaved caspase-3,Bax and p-ERK was detected by western blot assay.ResultsCCk-8 assay showed that methylglyoxal significantly decreased the viability of HK-2 cells in a dose-dependent manner (Plt;0.01).Also,methylglyoxal reduced mitochondrial membrane potential in HK-2 cells.In addition,the expressions of cleaved caspase-3,Bax and p-ERK1/2 were up-regulated by methylglyoxal (Plt;0.05).ConclusionMethylglyoxal induces significant injury and apoptosis in HK-2 cells.The underlying mechanism might be involved in the activation of ERK1/2 signaling pathway.

Methylglyoxal; apoptosis; HK-2 cells; ERK1/2

国家自然科学基金资助项目(NO:81560133)；贵州省科技合作计划项目(NO:黔科合LH字[2015]7529)；遵义医学院博士科研启动基金(NO:F-711)。

庄晓东，男，博士，研究方向：肾脏疾病的发病机制及药物防治，E-mail:kangfuyanling@126.com。

R691.6

A

1000-2715(2017)05-0526-05