郁征宇, 梁桂逢, 周龙宇, 徐晨曦, 王全华, 蔡晓锋

(上海师范大学 生命与环境科学学院 植物种质资源开发协同创新中心,上海 200234)

叶用莴苣(Lactucasativa)花青素提取技术的优化

郁征宇, 梁桂逢, 周龙宇, 徐晨曦, 王全华, 蔡晓锋*

(上海师范大学 生命与环境科学学院 植物种质资源开发协同创新中心,上海 200234)

以紫晶生菜为原料,柠檬酸水溶液为提取剂,分别研究了提取液浓度、浸提温度、固液比、浸提时间和浸提次数对花青素提取率的影响.在此基础上,采用三水平四因素安排实验,以520 nm为最大吸收波长,以吸光度为响应值,探讨浸提温度、浸提时间、提取液浓度和固液比对紫晶生菜花青素提取的影响,并对提取工艺进行优化.筛选出的最佳提取工艺条件为:提取剂质量浓度0.06 g/mL,浸提温度70 ℃,固液比1/70,浸提时间2 h,滤渣提取次数2次.

生菜; 柠檬酸; 提取; 花青素; 提取工艺

0 引 言

生菜(LactucasativaL.)又名叶用莴苣,菊科莴苣属,为一年生或二年生草本植物,是世界上重要的绿叶蔬菜之一.生菜按叶片的色泽划分为绿色生菜和紫色生菜两种.紫色生菜具有极高的营养价值,不仅富含蛋白质、糖类、维生素和矿物质等营养成分,而且含有丰富的花青素,具有清除自由基抗氧化功能、预防贫血、防癌、抗衰老、降低血压和防止心律紊乱等保健功能[1-4].

花青素(anthocyanin)又称花色素,是植物类黄酮生物合成途径中的重要次生代谢产物,属类黄酮化合物,主要以水溶性物质的形式存在于植物各个组织的细胞液泡中,是构成植物果实和花瓣颜色的主要色素之一[5].花青素是一类具有保健功能的活性成分,具有很高的药用价值及保健功能,花青素在食品、化妆品、医药、保健等领域有着巨大的应用潜力.天然色素直接取自于自然界中的动植物及微生物中,相比工合成色素更为安全可靠,是食品着色剂的发展趋势.

花青素提取是利用花青素的基础环节.关于花青素提取的报道很多,提取溶剂多为甲醇、乙醇、丙酮等有机试剂或者其混合液.毕云枫等[6]发现紫甘薯花青素的最佳提取剂为80%(体积分数)乙醇酸性溶液,固液比为1/10,60 ℃下浸提时间为3 h;樊婷等[7]以柠檬酸-乙醇为提取剂提取紫甘薯花青素,最佳提取工艺参数为柠檬酸质量浓度70 g/L,柠檬酸与乙醇的体积比为10/1,固液比为1/20,70 ℃浸提时间为2 h.蒋召雪等[8]以茄子皮为原料提取花青素,结果表明以70%(体积分数))乙醇为提取溶剂,固液比为1/20,60 ℃提取90 min,提取3次,茄子皮中花青素提取率最高.Zou等[9]以桑葚为原料,发现63.8%(体积分数)甲醇,固液比为1/23.8,43.2 ℃提取40 min最佳.紫色生菜也是花青素的一种资源,但却很少有紫色生菜中提取花青素工艺的研究.

本研究采用富含花青素,生长期短,可周年种植的紫色生菜品种为原料,以柠檬酸为提取剂,通过单因素实验及正交实验,研究浸提温度、浸提时间、固液比及pH值对花青素提取率的影响,以探索紫色生菜花青素的最佳提取工艺参数,提供一种绿色、环保、高效且成本低的花青素分离、纯化技术.

1 材料与方法

1.1材料与试剂

供试材料为紫晶生菜,由上海师范大学从美国引进品种Red oak leaf中经系统选育筛选出的耐热抗病酒红色生菜新品种.柠檬酸为分析纯,购买自国药集团.

1.2紫晶生菜预处理

选取新鲜的紫晶生菜样品,清洗干净,置于冷冻干燥机中干燥至恒重;然后用粉碎机粉碎,过80目(筛孔直径0.18 mm)的筛子,置于4 ℃的冰箱中避光保存,备用.

1.3生菜花青素提取工艺的单因素实验

1.3.1 紫晶生菜中花青素的最佳波长

用分析天平准确称取紫晶生菜粉末0.2 g,加入9 mL质量浓度为0.06 g/mL的柠檬酸提取剂,60 ℃恒温水浴,浸提60 min,抽滤,将滤液用紫外分光光度计在430～600 nm范围内进行吸光度测定,确定其最大吸收波长.

1.3.2 固液比的优化

分别取0.2 g紫晶生菜于具塞试管中,固液比依次为1/20、1/30、1/40、1/50、1/60、1/70、1/80、1/90、1/100,加入6%的柠檬酸提取剂依次为3、8、10、12、14、16、18、20 mL,60 ℃恒温水浴,提取1 h,抽滤,测定520 nm处的吸光度.

1.3.3 提取剂浓度的优化

由上述实验结果确定固液比为1/70,分别称取0.2 g紫晶生菜粉末于具塞比色管中,并分别用体积分数为0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的柠檬酸溶液作为提取剂.加入14 mL提取剂,在60 ℃恒温水浴中提取1 h,抽滤,测定520 nm处的吸光度.

1.3.4 浸提时间的优化

分别取0.2 g紫晶生菜粉末于具塞试管中,按固液比为1/70加入14 mL 6%柠檬酸提取剂,60 ℃恒温水浴,分别浸提1、2、3、4、5、6 h,抽滤,测定520 nm处的吸光度.

1.3.5 浸提温度的优化

分别取0.2 g紫晶生菜粉末于具塞试管中,按固液比为1/70加入14 mL 6%柠檬酸提取剂,浸提时间为2 h,浸提温度分别为20、30、40、50、60、70、80、90 ℃条件下浸提,抽滤后测定520 nm处的吸光度.

1.3.6 浸提次数的优化

分别取0.2 g紫晶生菜粉末于具塞试管中,按固液比为1/70加入14 mL 6%柠檬酸提取剂,浸提时间为2 h,浸提温度70 ℃,滤渣浸提次数分别为1、2、3、4次条件下浸提,抽滤后测定520 nm处的吸光度.

1.4生菜花青素提取的正交实验

参照单因子实验结果,进一步对影响紫晶生菜中花青素提取效果的主要因素:固液比、提取剂浓度、浸提时间和浸提温度进行正交实验设计,采用三水平四因素设计,以确定最佳的提取条件.多因素正交实验的四因素、三水平设置如表1所示.

表1 紫晶生菜中花青素提取条件正交实验的因素水平设计

1.5花青素测定方法

采用紫外可见分光光度法在波长520 nm处测得吸光值,以不同浓度的矢车菊素-3-葡萄糖苷标准品为横坐标,吸光度为纵坐标绘制标准曲线,并根据标准曲线计算待测样品中花青素含量.

2 结果分析

2.1紫晶生菜花青素提取率的单因素实验结果

2.1.1 波长对紫晶生菜花青素提取率的影响

图1 波长对紫晶生菜花青素提取的影响

图2 固液比对紫晶生菜中花青素提取率的影响

花青素标准品溶液和样品溶液制成显色检测液后最大吸收波长一致,均为 520 nm,因而确定紫晶生菜样品液中花青素含量测定波长为520 nm(图1).

2.1.2 固液比对紫晶生菜花青素提取率的影响

随着固液比的增加,花青素含量先快速增加,随后缓慢增长.当固液比在1/60～1/100范围内时,紫晶生菜花青素提取率较高;当固液比为1/70时,紫晶生菜花青素提取率最高,超过1/70提取率变化较小且趋于稳定,如图2所示.这是因为生菜中花青素含量有限,当提取剂达到一定比例后,花青素可能已完全浸出,当再提高提取剂比例时,提取率仍保持稳定.而固液比高于1/70时,花青素得率反而有所降低.这可能是因为溶剂用量过多溶解出了较多杂质,影响了花青素的提取.因此,该单因素实验测出最佳固液比为1/70.

2.1.3 提取剂浓度对紫晶生菜中花青素提取率的影响

当提取剂质量分数在3%～7%范围内时,紫晶生菜花青素提取率较高;当提取剂质量浓度为0.06 g/mL时,紫晶生菜花青素提取率最高,如图3所示.

2.1.4 浸提时间对紫晶生菜中花青素提取率的影响

紫晶生菜中花青素提取率在浸提时间为1～2 h范围内随时间延长而逐渐升高;当浸提时间为2 h时,提取率最高;当浸提时间大于2 h时,由于提取出原花青素与细胞内其他物质发生反应,使花青素含量降低,导致提取率下降.故浸提时间以2 h较为合适,如图4所示.

图3 提取剂浓度对紫晶生菜中花青素提取率的影响

图4 浸提时间对紫晶生菜花青素提取率的影响

2.1.5 浸提温度对紫晶生菜中花青素提取率的影响

在一定阶段内,随着温度的升高提取效果也在不断变优异,但如果继续升温,提取效果反而降低.因为虽然升温有利于色素的溶出,但花青素的稳定性较差,温度升高,花青素会发生氧化、聚合,导致提取率下降;温度低时,花青素与蛋白质、纤维等分离较慢,也会导致提取率下降.当浸提温度为60～80 ℃时,紫晶生菜花青素提取率较高;当浸提温度为70 ℃时,紫晶生菜花青素提取率最高,温度高于70 ℃时提取率缓慢下降,如图5所示.温度过高,一方面其中活性成分会受到破坏,杂质溶出量增加,给后续操作带来不便;一方面也会造成溶剂损失.综合以上因素,浸提温度应选70 ℃较为合适.

2.1.6 浸提次数对紫晶生菜中花青素的提取率的影响

当浸提次数为2次时,紫晶生菜花青素提取率达到87%;当浸提次数为3次时,紫晶生菜花青素提取率达到96%,如图6所示.实际生产中,浸提次数越多,提取率越高,但对应的成本越高,时间越久.考虑成本,在滤渣浸提次数为1～2次时,紫晶生菜花青素提取率较高,滤渣浸提次数为2次时的浸提效果更好.

图5 浸提温度对紫晶生菜花青素提取率的影响

图6 浸提次数对紫晶生菜花青素提取率的影响

2.2紫晶生菜花青素提取的正交实验结果

参照单因子实验结果,对影响紫晶生菜中花青素提取效果的主要因素:固液比、提取剂浓度、浸提时间和浸提温度进行正交实验设计,采用三水平四因素安排实验,以确定最佳工艺参数.实验浸提结果与数据计算如表2所示.根据各因素折算对实验数据进行极差分析.极差越大表明该因素对实验结果的影响越大.

在正交实验中得出的最优因素组合为A3B3C2D1方案,即以520 nm为最大吸收波长,分别取5 g紫晶生菜粉末于三角烧杯中,固液比为1/70,提取剂质量浓度为0.07 g/mL,浸提时间为2 h,浸提温度为60 ℃,滤渣提取次数2次.做三组平行实验,测得紫晶生菜花青素质量分数分别为7.21、7.22、7.24 mg/g.与正交实验的结果相比,每组实验结果都是最优的,故从正交实验得出的最佳优工艺参数经验证合理.

由上述单因素实验和正交实验的结果分析,能够看出:单一因素对浸提效果的影响顺序从大到小依次为提取剂浓度、固液比、浸提温度、浸提时间.

表2 正交实验结果

注:Ti表示正交实验中第i次实验的和,Xi表示正交实验中第i次实验的平均值,R表示极差.

3 讨 论

花青素提取溶剂选择主要是依据“相似相溶原理”.极性与花青素极性越接近,花青素在溶液中溶解度越大.目前,根据文献报道,花青素提取溶剂主要选择甲醇和乙醇两种,一般加入0.1%(体积分数)盐酸进行提取,因为花青素在酸性条件下,性质较稳定,不会很快分解.本实验采用柠檬酸进行提取,安全、无毒、健康.

花青素在酸性条件下比较稳定,但过度酸化容易破坏花青素的天然结构,所以一般采用醇溶液酸化法或者弱酸性的有机酸溶液作为提取剂提取花青素.生菜中花青素提取量随pH值不同而变化,酸度的增加有利于色素的提取,但酸度太高,会降低色素的提取率,因此将提取剂的pH值调节在合适的范围(2.5～3)内,可获得较高的色素提取率,得到色泽鲜艳的生菜天然色素.本实验采用质量浓度为0.05 g/mL的柠檬酸溶液作为提取溶剂,达到生菜最佳提取效果,与之相符[6-9].

浸提时间的延长虽然有利于色素的提取,但较高温度下的长时间浸提将引起甘薯色素的降解,反而降低总的提取效率.实验表明,在70 ℃浸提2 h,可获得较高的提取率.此浸提时间与樊婷等[7]以柠檬酸-乙醇为提取剂提取紫甘薯花青素中适宜浸提时间相同.

色素的提取率随温度的升高而增加,但浸提温度超过70 ℃时,对提高色素提取率的影响并不十分显著,且有可能破坏花青素的基本结构而影响其稳定性,此温度与樊婷等[7]以柠檬酸-乙醇为提取剂提取紫甘薯花青素中适宜浸提时间相同,比毕云枫等[6]提取紫甘薯花青素的最适浸提温度(60 ℃)略高;这可能与材料种类和提取剂不一样有关.

本研究通过单因素实验和正交实验,在恒温水浴中利用柠檬酸浸提法提取紫晶生菜中花青素,得到最优工艺参数为:提取剂质量浓度0.06 g/mL、浸提温度70 ℃、固液比1/70、浸提时间2 h、滤渣提取2次.该提取方法操作简便,提取率高,成本低,且提取的花青素更具使用安全性.

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(责任编辑:顾浩然,郁 慧)

Optimizationoftechniqueforextractinganthocyaninsfromlettuce(Lactucasativa)

Yu Zhengyu, Liang Guifeng, Zhou Longyu, Xu Chenxi, Wang Quanhua, Cai Xiaofeng*

(Development Center of Plant Germplasm Resources,College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234,China)

We investigated the effects of extraction mass concentration,liquid-to-solid rate,temperature,and extraction time and frequency on the extraction rate of anthocyanin from purple lettuce by using citric acid solution as the extraction agent.Then,the orthogonal test of four factors and three levels were performed with the maximum absorption wavelength for 520 nm,and absorbance as response value.The effects of extraction temperature,extraction time,extract mass concentration and solid-liquid ratio on the extraction rate of anthocyanin were discussed through orthogonal test,and the optimum technique for extracting lettuce was obtained.The result showed the optimal extraction condition was as follows:citric acid mass concentration 0.06 g/mL,extraction temperature 70 ℃,ratio of material-liquid 1/70,extraction time 2 h,and extraction 2 times.

lettuce; citric acid; extraction; anthocyanins; extraction process

S 636.2

A

1000-5137(2017)05-0641-06

2017-08-23

国家自然科学基金青年基金(31501754);上海市协同创新中心项目(ZF1205);上海植物种质资源工程技术研究中心项目(17DZ2252700)

郁征宇(1993-),男,硕士研究生,主要从事蔬菜遗传育种及分子生物学方面的研究.E-mail:1027506153@qq.com

导师简介: 蔡晓锋(1986-),男,博士,讲师,主要从事蔬菜遗传育种及分子生物学方面的研究.E-mail:cxf0012@163.com

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