刘兰英，吴嘉龄，王和生△，吴文忠，张 聪，刘成勇，秦 珊，陈 栋

(1. 南京中医药大学附属医院，南京 210029； 2. 南京中医药大学，南京 210000)

【针灸研究】

穴位贴敷诱发小鼠背部接触性皮炎模型的建立与评价❋

刘兰英1，吴嘉龄2，王和生1△，吴文忠1，张 聪1，刘成勇1，秦 珊1，陈 栋1

(1. 南京中医药大学附属医院，南京 210029； 2. 南京中医药大学，南京 210000)

目的：探讨穴位贴敷诱发小鼠背部接触性皮炎模型制备及评价方法。方法：以经典的2,4-二硝基氟苯 (DNFB)诱发的小鼠背部接触性皮炎模型作为参照，制备不同穴位贴敷方法诱发的小鼠背部接触性皮炎模型，观察皮损肉眼下及光镜下组织病理学特点。结果：肉眼下穴位贴敷造模小鼠皮损与DNFB造模小鼠皮损颜色、形态、质地等相似，符合接触性皮炎肉眼下表现。光镜下皮损组织病理学均示穴位贴敷诱发接触性皮炎模型小鼠皮损皮肤表皮角质层破坏，真皮层炎细胞浸润与DNFB诱发接触性皮炎模型小鼠表现存在高度相似性，符合接触性皮炎的病理学改变。结论：成功建立穴位贴敷诱发的小鼠背部接触性皮炎模型，以肉眼下及光镜下病理作为评价方法。

穴位贴敷；接触性皮炎模型；小鼠

在穴位贴敷治疗哮喘的长期临床实践中观察到，相当一部分患者在治疗过程中贴敷部位皮肤产生红斑、丘疹甚至水疱等皮肤反应，符合接触性皮炎表现[1]。本研究前期结果显示，穴位贴敷可诱发患者背部接触性皮炎[2]。并有临床研究认为，出现皮炎的哮喘患者疗效优于未出现皮炎的患者[3]。但如何通过穴位贴敷诱发小鼠背部接触性皮炎模型，以模拟人类穴位贴敷所致的背部接触性皮炎，目前国内外暂未发现相关研究。本研究拟通过以经典的2,4-二硝基氟苯 (DNFB)诱发小鼠背部接触性皮炎模型作为参照，从肉眼皮损及光镜下皮损病理学角度评价穴位贴敷诱发小鼠背部接触性皮炎模型与其相似度，从而评价穴位贴敷方法诱发的接触性皮炎模型是否成功。

1 材料

1.1 动物

SPF级BALB/c雌性小鼠24只，6～8周龄，体质量(20±2) g，上海灵畅生物科技有限公司提供(许可证号SCXK[沪]2013-0018，合格证编号2013001812558)。

1.2 试剂及仪器

DNFB丙酮溶液：将丙酮:橄榄油(化学纯CP，上海凌峰化学试剂有限公司，批号Lot.No.20150617)按4∶1作为基液配成0.2%、0.5% 2种浓度的DNFB丙酮溶液(DNFB-A5512为东京化成工业株式会社产品，批号Lot.2WTMO-GM)备用，现用现配； 穴位贴敷药贴：配伍组方源自南京中医药大学附属医院针灸康复科经验方，剂型由本院制剂部制备，将白芥子(2份)、延胡索(2份)、生甘遂(1份)、细辛(1份)、麻黄(1份)、葶苈子(1份)、丁香(1份)、肉桂(1份)、牙皂(1份)共9味中药，各自打粉过80目筛，充分混合，每100 g混合药粉中加入70 mL鲜生姜汁及30 mL液态凡士林，混匀后制成直径0.5×0.5 cm，质量约0.5 g的药帖，置于医用胶布上备用；宠物电推剪(深圳科德士电器有限公司，CP5000)。

2 方法

2.1 分组

将BALB/c小鼠随机分为空白组、DNFB模型组、每日贴敷模型组及隔日贴敷模型组4组各6只。

2.2 造模方法

空白组：第1天电推剪于背部3×4 cm范围去毛之后正常饲养，定期观察。DNFB组：参考王国江[4]方法进行改良，于背部致敏及激发并减少刺激量以防止皮损过重，同空白组去毛备皮，第2天于背部备皮处均匀涂抹0.5%DNFB 25 μl进行诱导致敏，第5天于背部致敏处均匀涂抹0.2%DNFB 20 μl进行激发。 每日贴敷模型组：第1天备皮同前，第2天开始每天于背部去毛区(约两侧膀胱经上)贴敷咳喘停药贴4贴，每次贴敷4 h，用纸胶带固定，每天1次，共贴敷14 d。隔日贴敷模型组：第1天去毛备皮方法同前，第2天开始隔天贴敷药贴方法时长固定同前，隔天1次，共贴敷14 d。

2.3 观察指标及方法

2.3.1 各组小鼠造模完成后肉眼下皮损特点 观察时间DNFB模型组及贴敷模型组于末次激发及末次贴敷24 h后，空白组观察时间同贴敷模型组。观察小鼠背部皮肤颜色、形态及质地，评价穴位贴敷与DNFB诱发的小鼠背部接触性皮炎模型相似度。

2.3.2 各组小鼠皮损处镜下组织形态学特点 观察时间于肉眼观察完皮损取下制作HE染色后。取材方法：用4%水合氯醛(0.2 ml/20 g)腹腔注射麻醉，待检处皮肤用医用碘伏消毒后在眼科镊固定下用眼科弯剪剪取0.5×0.5 cm大小的皮肤，用10%中性甲醛液固定脱水、石蜡包埋、切片；行HE染色，在光镜下观察各组皮损处皮肤病理学特点，评价穴位贴敷与DNFB诱发的小鼠背部接触性皮炎模型相似度。

3 结果

3.1 各组小鼠造模完成后肉眼下皮损特点

图1显示，空白组皮肤红润、完整，肤质柔软，未见明显异常；DNFB模型组皮肤肿胀、增厚，质地较正常组稍硬，个别小鼠出现轻微皮损，未见溃烂结痂等严重皮损表现。每日贴敷模型组小鼠背部贴敷处皮肤中度红肿，多数小鼠皮肤可见少量破溃。隔日贴敷模型组小鼠背部贴敷处皮肤轻度的红肿，少量可见皮肤破溃。

图1 小鼠造模后皮损部位肉眼观察注：A.空白组；B.DNFB模型组；C.每日贴敷模型组；D.隔日贴敷模型组

图2 小鼠造模后皮损组织HE染色(×100)注：A.空白组；B.DNFB模型组；C.每日贴敷模型组；D.隔日贴敷模型组

3.2 各组小鼠造模完成后皮损处皮肤标本组织形态学特点

图2显示，空白组小鼠皮肤表皮层及真皮层结构完整，可见较多毛囊、皮脂腺及汗腺。DNFB模型组小鼠皮肤表皮层的角质层破坏，真皮层的水肿伴炎细胞浸润及胶原纤维断裂。每日贴敷模型组小鼠背部贴敷处皮肤造模后表皮角质层结构紊乱，部分破坏伴增厚，棘层细胞大量增生，棘层明显增厚，真皮层大量炎症细胞浸润。隔日贴敷模型组小鼠背部贴敷处皮肤造模后表皮层的角质层结构紊乱，棘层细胞增生，真皮层水肿伴炎细胞浸润。

4 讨论

目前国内外并未见到穴位贴敷方法制作的小鼠接触性皮炎模型，仅有穴位贴敷方法治疗不同疾病模型小鼠的研究[5-9]。经典的DNFB诱发小鼠接触性皮炎模型已有较为成熟的制备方法[10-11]。有人用DNFB于昆明小鼠腹部诱导制作耳部及背部激发的小鼠接触性皮炎模型，成功建立了小鼠的背部接触性皮炎模型[4]。也有人用DNFB背部致敏与激发BALB/c小鼠，产生的皮肤组织肉眼及形态学特点改变与接触性皮炎患者表现一致[12]。本实验旨在建立穴位贴敷方法诱发的小鼠背部接触性皮炎模型，以模拟患者背俞穴穴位贴敷治疗后产生的接触性皮炎，故选择小鼠DNFB背部致敏及背部激发造模方法制作模型作为参照，以评价穴位贴敷方法诱发的接触性皮炎模型是否成功。实验方法拟在王翼腾[13]及李圆圆[14]等多次用DNFB反复于小鼠背部进行激发后产生较严重的皮肤炎症变化的基础上，建立更接近于临床中患者穴位贴敷诱发的轻中度接触性皮炎皮肤反应[2]，因此在建立DNFB模型时进行了减少刺激量的改良。有研究显示，末次激发后24～48 h时接触性皮炎皮肤炎症表现最明显[15]，故将实验观察点设于末次激发24 h后。

本实验DNFB模型结果显示，肉眼下见皮损处皮肤红肿、增厚，部分小鼠出现皮肤破溃，但未见大面积溃烂结痂等严重皮损表现。光镜下示，小鼠背皮损真皮层水肿且炎细胞浸润，胶原纤维断裂，皮肤角质层破坏，符合接触性皮炎的病理学改变，成功复制了DNFB致小鼠背部接触性皮炎模型，可用作穴位贴敷方法造模的参照。

在穴位贴敷诱发小鼠接触性皮炎模型制备方法中，参考小鼠穴位贴敷治疗方法[8、16-17]及临床患者穴位贴敷方法[18-19]等，分别采用每日及隔日贴敷，疗程选择为2周。穴位贴敷造模结果示，肉眼下皮损处皮肤红肿，部分小鼠皮肤水肿及破溃，可触及增厚、变硬。每日穴位贴敷模型组较隔日穴位贴敷模型组皮肤皮损及炎症程度更重。光镜下皮肤组织形态学示，2种穴位贴敷方法均造成小鼠贴敷部位皮肤表皮角质层增厚及结构紊乱、棘层增生、真皮层炎细胞浸润，每日贴敷的角质层增厚并结构紊乱及炎症程度比隔日贴敷的更重。2种穴位贴敷方法均可成功建立穴位贴敷诱发的小鼠背部接触性皮炎模型，每日贴敷较隔日贴敷炎症程度重。该模型可模拟患者穴位贴敷治疗后背部接触性皮炎改变[20-21]，为以后进一步研究穴位贴敷诱发的接触性皮炎对哮喘治疗作用的效应机制研究打下基础。

本研究造模关键环节包括使用的药物即喘咳停药贴中含有白芥子、甘遂、生姜等药物具有较强的皮肤刺激作用有关。贴敷频率选择上，隔日贴敷所致皮肤反应较轻，而每日贴敷所致皮肤反应更重。

本研究的不足之处在于，DNFB造模未区分急慢性接触性皮炎。本实验DNFB造模后更接近于急性接触性皮炎模型，而穴位贴敷造模方法为小剂量多次重复刺激的慢性接触性皮炎模型。今后可制作DNFB致慢性接触性皮炎模型作为参照。

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TheEstablishmentandEvaluationofAMiceModelofBackContactDermatitisInducedbyAcupointSticking

LIU Lan-ying1, WU Jia-ling2, WANG He-sheng1△, WU Wen-zhong1, ZHANG Cong1, LIU Cheng-yong1, QIN Shan1, CHEN Dong1

(1.AffiliatedHospitalofNanjingUniversityofTCM，Nanjing210029,China; 2.NanjingUniversityofChineseMedicine，Nanjing210000,China)

Objective: To establish and evaluate a mice model of back contact dermatitis which is induced by acupoint sticking. Methods: Compare to the classical contact dermatitis mice model which is induced by 2,4-dinitrofluorobenzene(DNFB), we established a mice model of back contact dermatitis induced by different acupoint sticking methods. We observed the macroscopic and microscopical characteristics of skin lesions with different kinds of acupoint sticking. Results: we found the high resemblance of the color, shape and texture between acupoint sticking models and DNFB model. Acupoint sticking models were highly in accord with DNFB model in the changes of epidermal damage and dermis inflammatory cells infiltration under the light microscope, which fitted in the changes of contact dermatitis. Conclusion:We successfully established a mice model of back contact dermatitis induced by acupoint sticking, the method was evaluated by macroscopic and microscopic pathology.

Acupoint Sticking; Contact Dermatitis Model; Mice

R244.9

A

1006-3250(2017)10-1433-03

国家自然科学基金资助项目(81674065)-基于Th1免疫应答增强探讨穴位贴敷诱发接触性皮炎对哮喘气道炎症的反向调节机制;江苏省科技厅重点研发计划(社会发展)项目(BE2017771)-基于拉曼光谱原位监测皮炎程度的穴位贴敷技术治疗哮喘的临床研究；江苏省中医药局项目(YB2017026)-咳喘停巴布剂穴位贴敷治疗哮喘复发的中医康复临床研究

刘兰英(1974-)，女，重庆人，主任医师，医学博士，硕士研究生导师，从事穴位贴敷治疗哮喘疗效评价及效应机制研究。

△通讯作者：王和生(1965-)，男，江苏人，主任医师，医学博士，硕士研究生导师，从事针灸治疗呼吸系统及神经系统疾病的临床与研究，Tel：025-86617141-31318,E-mail：wanghesheng2010@126.com。

2017-03-08