毛贻玺，刘凤军，张玉玲，付晓森，董文亚

(河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003)



钼对白消安致小鼠不孕不育症模型繁殖障碍的影响

毛贻玺，刘凤军，张玉玲，付晓森，董文亚

(河南科技大学 动物科技学院，河南 洛阳 471003)

为了研究钼对白消安致小鼠不孕不育症模型繁殖障碍的影响，通过单次腹腔注射30 mg/kg白消安构建昆明白小鼠不孕不育症模型。将不孕不育症的雄鼠和雌鼠随机各分为4组，雄鼠饮用水中钼质量浓度为0 mg/L、12.5 mg/L、25.0 mg/L和50.0 mg/L，雌鼠饮用水中钼质量浓度为0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L。饮钼后第1～4周剖取雄鼠睾丸、附睾及雌鼠卵巢，计算附睾及卵巢系数，同时对睾丸及卵巢切片用苏木精-伊红(HE)染色法染色。研究结果表明：雄鼠12.5 mg/L钼组的睾丸形态结构恢复速度较快，附睾系数显著提高，各级精原细胞的层数增多，排列紧密有序；雌鼠2.5 mg/L钼组的卵巢形态结构恢复较好，卵巢内率先出现卵母细胞。钼在适宜剂量12.5 mg/L(雄鼠)或2.5 mg/L(雌鼠)时，对不孕不育小鼠睾丸或卵巢功能有明显恢复作用。

钼；繁殖障碍；白消安；不孕不育；睾丸；卵巢

0　引言

随着社会的发展，不孕不育症的发病率越来越高[1]，全世界约有15%的夫妇患有不孕不育症[2]。这可能是由于环境、食物或其他消费品中存在的一些物质，干扰了与机体正常生殖机能有关的激素合成与代谢[3]。导致不孕不育的原因包括生精障碍、排卵障碍、子宫畸形、输卵管阻塞、腹膜因素和宫颈因素等[4]。迄今为止，许多技术已被应用于治疗不孕不育症，如辅助生殖技术[5]、体外受精技术、胚胎移植技术[6]和精原干细胞移植技术[7-8]等。尽管治疗不孕不育症的研究取得了很大的进展，但总体治愈率(<41%)仍然较低。因此，仍需进一步探索高效的治疗方法。

钼(Mo)是机体必需的微量元素之一，对人类及动物保持正常代谢有重要作用[9-10]。钼可以通过催化羟基化、氧原子转移和其他氧化还原反应，促进机体内物质的新陈代谢和某些代谢产物的排出[11-12]，能对机体的多种组织或器官产生影响。在本课题组前期的研究中发现：钼对小鼠雌性及雄性生殖器官(卵巢和睾丸)具有正反两方面的作用[13-14]。文献[13]报道：小鼠饮用钼质量浓度高于20 mg/L后，卵巢充血，并伴有MII期卵母细胞形态异常及卵巢质量减轻；然而，饮用钼质量浓度为5 mg/L时，能够显著提高排卵数量和MII期卵母细胞质量。文献[14]的研究表明：小鼠饮用钼质量浓度为25 mg/L时，能够显著提高雄性小鼠的多个生殖参数。上述研究表明：适当剂量的钼可以改善哺乳动物雌性及雄性的生殖功能。据此，可以推测：钼有可能有治疗不孕不育症的功效，但目前尚未见到相关研究。

本文用白消安[15-16]制作了不孕不育症的小鼠试验动物模型，然后，对模型小鼠实施饮钼处理，通过观察雄性和雌性生殖器官组织形态结构及其参数的变化，探索了钼对小鼠不孕不育症模型繁殖障碍的影响。

1　材料和方法

1.1试验动物

试验动物为5～6周龄、体质量25～30 g的雌性和雄性昆明白小鼠，购自山东鲁抗医药股份有限公司实验动物室(生产许可证号SCXK鲁20130001、SPF级昆明种小鼠)。小鼠自由采食饮水，饲养环境温度(25±2) ℃，湿度40%～70%。每天光照时间10～12 h。

1.2主要试剂

白消安(C6H14O6S2)、二甲基亚砜(DMSO，购自郑州鼎国生物公司)、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O，购自天津化学试剂四厂)、透明质酸酶、孕马血清促性腺激素(PMSG 1 000 UI/支，购自宁波市三生药业有限公司)、人绒毛膜促性腺激素(HCG 1 000 UI/支，购自宁波市三生药业有限公司)，其他试剂均购自Sigma公司。

1.3试验方法

通过单次腹腔注射30 mg/kg的白消安构建昆明白小鼠不孕不育症模型，注射白消安后的第30 天，将雄鼠和雌鼠随机各分为4组，每组140只。雄鼠饮水中分别添加0 mg/L、12.5 mg/L、25.0 mg/L和50.0 mg/L的钼，雌鼠饮水中分别添加0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L的钼，开始持续饮钼试验。在饮钼开始后的第1周、第2周、第3周和第4周，剖取雄鼠睾丸、附睾及雌鼠卵巢，计算附睾及卵巢系数，同时对睾丸及卵巢切片用苏木精-伊红(hematoxylinand eosin,HE)染色法染色。与对照组相比，试验组相关生殖参数的恢复程度为生殖功能恢复的判定依据。

1.4数据分析

试验采用SPSS 17.0 统计软件进行单因素方差分析(ANOVA)，用Duncan法进行多重比较，P<0.01表明差异极显著，P<0.05表明差异显著，P>0.05表明差异不显著，数据以均数±标准差的形式表示。

2　结果

2.1白消安对雄性小鼠生殖参数的影响

白消安对雄性小鼠生殖参数的影响见表1，对睾丸形态的影响见图1。由表1可知：注射30 mg/kg白消安30 d后，与对照组相比，试验组附睾系数极显著降低(P<0.01)；附睾中无可见精子，精子密度和精子活力为0，无精子畸形率。与对照组睾丸形态(见图1a)相比，注射白消安后第10天，睾丸内基底膜生殖细胞开始减少，精子未受影响(见图1b)。注射白消安后第20天，睾丸内基底膜的生精细胞几乎消失，曲细精管内有脱落的生殖细胞，精子数量明显减少(见图1c)。注白消安后第30天，睾丸曲细精管呈薄空管状，基底膜的生殖细胞消失，无精子(见图1d)。

表1　白消安对雄性小鼠生殖参数的影响

注：同列上标字母不同表示差异极显著(P< 0.01)。

图1　白消安对睾丸形态的影响

2.2白消安对雌性小鼠生殖参数的影响

白消安对雌性小鼠生殖参数的影响见表2，对卵巢形态的影响见图2。由表2可知：注射 30 mg/kg

表2　白消安对雌性小鼠生殖参数的影响

注：同列上标字母不同表示差异极显著(P<0.01)。

白消安30 d后，卵巢系数、排卵数和畸形率情况均有显著变化。与对照组相比，试验组卵巢系数明显降低，差异极显著(P<0.01)，此时卵巢中无卵子。与对照组的卵巢形态(见图2a)相比，注射白消安后第10天，卵巢内出现空洞，卵细胞有受损迹象(见图2b)；第20天，卵巢内的空洞面积显著增大，无卵细胞(见图2c)；第30天，卵巢内空洞充满整个卵巢，无卵细胞(见图2d)。

图2　白消安对卵巢形态的影响

2.3钼对不育雄鼠附睾系数的影响

钼对不育雄鼠附睾系数的影响见表3。由表3可看出：饮钼后的第1周和第2周，与对照组相比，50 mg/L组的附睾系数明显降低(P<0.01)，12.5 mg/L组和25.0 mg/L组的附睾系数虽有升高，但无显著变化。第3周试验各组与对照组相比差异不显著。第4周与对照组相比，12.5 mg/L 组附睾系数极显著升高(P<0.01)，25.0 mg/L组和50.0 mg/L组无显著差异。

表3　钼对不育雄鼠附睾系数的影响

注：同列上标字母不同表示差异极显著(P<0.01)。

2.4钼对不育雄鼠睾丸组织的影响

不育雄鼠饮钼后，睾丸曲细精管变化见图3。图3中：第1组钼质量浓度为0 mg/L；第2组钼质量浓度为12.5 mg/L；第3组钼质量浓度为25.0 mg/L；第4组钼质量浓度为50.0 mg/L。第1组：第1～2周睾丸曲细精管呈薄空管状(见图3中a1和a2)；第3周曲细精管内部分生精细胞开始增殖(见图3中a3)；第4周，管腔中出现生精细胞层(见图3 中a4)。第2组：第1周，曲细精管呈薄的空管状，曲细精管内无生精细胞(见图3 中b1)；第2周，管腔内生殖细胞开始增殖(见图3中 b2)；第3周，生精细胞增殖缓慢，为1～2层(见图3中b3)；第4周，生殖细胞层数增加到3～5层(见图3中b4)，排列紧密，整齐有序。第3组：第1周，管腔呈薄空管状，曲细精管内无生殖细胞(见图3 中c1)；第2～3周，管腔中见1～2层生殖细胞，排列紊乱松散(见图3中c2和c3)；第4周，生殖细胞增殖0～4层，排列不均匀、紊乱松散(见图3中 c4)；第4组：第1～3周管腔呈薄空管状，生精细胞层无恢复，睾丸曲细精管内无生精细胞层(见图3 中d1～d3)；第4周，生殖细胞增殖1～2层，层数分列不均，稀疏散乱(见图3中d4)。

2.5钼对不孕雌鼠卵巢系数的影响

钼对不孕雌鼠卵巢系数的影响见表4。由表4可看出：第1～3周，0 mg/L、2.5 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L组间卵巢系数差异不显著；第4周，2.5 mg/L、5.0 mg/L和10.0 mg/L组对卵巢系数均有恢复作用，5.0 mg/L组的卵巢系数极显著高于对照组(P<0.01)。

表4　钼对不孕雌鼠卵巢系数的影响

注：同列上标字母不同表示差异极显著(P<0.01)。

2.6钼对不孕雌鼠卵巢组织的影响

不孕雌鼠饮钼后第1～4周，卵巢组织HE染色结果如下：第1组质量浓度为0 mg/L；第2组质量浓度为2.5 mg/L；第3组质量浓度为5.0 mg/L；第4组质量浓度为10.0 mg/L。第1组：第1～3周，卵巢组织的空洞逐渐减少，卵巢组织逐渐恢复，但无卵泡细胞；第4周，卵巢组织大面积恢复，仍无卵泡细胞。第2组：第1～3周卵巢组织的空洞逐渐减少，卵巢组织慢慢恢复，无卵泡细胞；第4周，卵巢组织中有少许空洞，几乎全部恢复且可见卵泡细胞。第3组和第4组：恢复程度与第1组类似，空洞减少，卵巢组织渐渐恢复，无卵泡细胞。

3　讨论

本文研究结果显示：适宜剂量的钼对不孕不育症模型小鼠的生殖功能有治疗作用。对雄性不育小鼠，在本文研究的4个质量浓度中，12.5 mg/L的钼附睾系数显著高于对照组，这表明附睾损伤得到了明显的恢复，精子成熟场所在逐步改善。12.5 mg/L 钼增加了睾丸生精功能，管腔中各级生精细胞也有所增加，从基底膜开始恢复，增殖到3～5层，排列整齐有序。文献[14]的研究结果显示：给健康小鼠饮用质量浓度为 25.0 mg/L 的钼，降低了睾丸过氧化损伤程度，睾丸质量得到明显改善，这与本文研究结果一致。

钼是人与动物所需的微量营养元素，有重要的生物学作用。适量钼能提高机体内细胞免疫力，增加细胞对病毒的抵抗力，对生殖系统有积极作用，可以提高生殖参数。文献[17]饲喂小鼠钼后发现：可以提高睾丸中超氧化物歧化酶的活性，显著降低丙二醛含量，使睾丸组织氧化程度下降，睾丸功能增强。

对雌性不孕小鼠，饮钼质量浓度在2.5 mg/L时显著增加了卵巢系数，这表明卵巢组织功能得到了明显的恢复。卵巢组织切片结果表明，2.5 mg/L组卵巢组织恢复显著比其他组的卵巢组织恢复快，至第4周，卵巢组织中剩余少许空洞，卵巢内率先出现卵泡细胞。这有可能是由于钼降低了不孕症小鼠卵巢的氧化损伤，恢复了卵巢的功能。氧化应激是造成卵巢损伤，卵母细胞畸形，最终导致雌性不孕的原因之一。文献[13]研究发现：5 μg/mL的钼能够降低小鼠卵巢的氧化损伤，改善卵巢的功能，显著提高排卵的数量并降低卵母细胞畸形率，这与本研究结果接近。

综上所述，钼在适宜的剂量(雄鼠12.5 mg/L，雌鼠2.5 mg/L)时，对不孕不育症小鼠的生殖机能障碍有明显的治疗作用，有可能成为治疗不孕不育症的一种新的候选药物。

[1]DIAMANTI-KANDARAKIS E,BOURGUIGNON J P,GIUDICE L C,et al.Endocrine-disrupting chemicals:an endocrine society scientific statement[J].Endocrine reviews,2009,30(4):293-342.

[2]AGARWAL A,MULGUND A,HAMADA A,et al.A unique view on male infertility around the globe[J].Reprod biology and endocrinology,2015,13(1):37-45.

[3]MARQUES-PINTO A,CARBVALHO D.Human infertility are endocrine disruptors to blame[J].Endocrine connections,2013,2(3):15-29.

[4]LINDSAY T J,VITRIKAS K R.Evaluation and treatment of infertility[J].Am fam physician,2015,91(5):308-414.

[5]LUKE B,BROWN M B,NAGENT C,et al.Risk factors for adverse outcomes in spontaneous versus assisted conception twin pregnancies[J].Fertil steril,2004,81(2):315-319.

[6]BELOOSEKY R,KOL S.LIGHTMAN A,et al.Ovarian stimulation in in vitro fertilization with or without the “long” gonadotropin re-leasing hormone agonist protocol:effect on cycle duration and outcome[J].Fertil and steril,2000,74(1):166-168.

[7]HEM S,VON S V,SCHLATT S.Spermatogonia:stem cells with a great perspective[J].Reproduction,2001,121(6):825-834.

[8]ORWIG K E,SHINOHARA T,AVARBOCK M R,et al.Functional analysis of stem cells in the adult rat testis[J].Biology of reproduction,2002,66(4):944-949.

[9]王佳炜.微量元素钼的生理作用及其对机体功能的影响研究进展[J].医学综述,2013,19(19):3460-3463.

[10]王宏伟,赵静,杜祥月,等.钼对雌性小鼠骨骼形态结构的影响[J].河南科技大学学报(自然科学版),2014,35(6):71-74.

[11]SHERKHOV Z,KURDANOV K A,SHERKHOVA L K.Effects of molybdenum and hypoxia on the cardiovascular system of experimental animals[J].Aviakosm ekolog med,2012,46(5):51-54.

[12]TURNLUND J R,KEYED W R,PEIFFER G L,et al.Molybdenum absorption,excretion and retention studied with stable isotopes in young men at five intakes of dietary molybdenum[J].American journal of clinical nutrition,1995,62:790-796.

[13]ZHANG Y L,LIU F J,CHEN X L,et al.Dual effects of molybdenum on mouse oocyte quality and ovarian oxidative stress[J].Systems biology in reproductive medicine,2013,59(6):312-318.

[14]ZHAI X W,ZHANG Y L,QI Q,et al.Effects of molybdenum on sperm quality and testis oxidative stress[J].Systems biology in reproductive medicine,2013,59(5):251-255.

[15]BISHOP J B,WASSOM J S.Toxicological review of busulfan (Myleran)[J].Mutation research/reviews in genetic toxicology,1986,168(1):15-45.

[16]WANG J,XUE X,FAN C,et al.Establishment of recipient model for spermatogonial stem cells transplantation in Kunming mice[J].Tissue & cell,2014,46(4):249-254.

[17]李建喜,王学智,杨志强.钼和铜对小鼠抗氧化机能的影响[J].中国兽医科技,2004,34(11):22-26.

国家自然科学基金项目(30901026);河南省高等学校青年骨干教师基金项目(2010GGJS-071)

毛贻玺(1988-),女,河南新乡人,硕士生;刘凤军(1979-),男,通信作者,内蒙古赤峰人,副教授,博士,硕士生导师,主要研究方向为动物生殖疾病与生殖调控.

2015-10-20

1672-6871(2017)01-0073-05

10.15926/j.cnki.issn1672-6871.2017.01.015

S854

A