任谓明 ， 孙 铭 ， 叶 明 ， 赵 丹

(1．吉林农业大学 农业部参茸产品质量监督检验测试中心 ， 吉林 长春 130118 ； 2.吉林省通化市动物疫病预防控制中心 ，吉林 通化 134001 ； 3.吉林特研生物技术有限责任公司 ， 吉林 长春 130122)

犬细小病毒敦化株的分离与鉴定

任谓明1， 孙 铭2， 叶 明3， 赵 丹1

(1．吉林农业大学 农业部参茸产品质量监督检验测试中心 ， 吉林 长春 130118 ； 2.吉林省通化市动物疫病预防控制中心 ，吉林 通化 134001 ； 3.吉林特研生物技术有限责任公司 ， 吉林 长春 130122)

为了丰富我国延边地区犬细小病毒流行病学研究资料，为进一步研究有效的疫苗及诊断试剂做前期基础工作。采集延边州敦化市地区疑似犬细小病毒感染病犬的粪便样品，经过预处理后同步接种猫肾细胞(F81)，盲传至细胞出现明显病变，经形态学、分子生物学、免疫学等方法进行分析鉴定。结果：分离到的病毒可使F81细胞出现特异性病变、电镜下可见清晰的病毒粒子、其培养物可使红细胞发生凝集且能被特异性阳性血清所抑制、用特异性引物进行PCR检测结果呈阳性、免疫荧光试验可见培养物出现特异性绿色荧光，针对其VP2序列建立的进化树显示其与new CPV-2b型犬细小病毒有较高的同源性。结论：通过上述试验确定分离出1株犬细小病毒，分离的病毒为new CPV-2b型，命名CPV-DH-3株。

犬细小病毒 ； CPV-DH-3株 ； 分离 ； 鉴定

犬细小病毒(CPV)属于细小病毒科，细小病毒属，无囊膜自主复制的单股负链线性DNA病毒。CPV可引起犬细小病毒病和非化脓性心肌炎，该病具有发病率高、传染性强、病死率高的特点，是危害我国乃至世界养犬业最为严重的传染病之一。犬细小病毒在世界范围内广泛传播，该病毒于1978年首次报道，此后不断有新的变异株被发现，感染动物由最初的犬科动物扩展到猫科动物，引起严重的传染性出血性肠炎和心肌炎。犬细小病毒致病株为CPV-2型，其经过多年的衍变已经变异出多种亚型(CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c等)，不同毒株间抗原性、致病性及宿主范围有所差异。本研究从延边敦化地区分离出1株犬细小病毒，通过细胞病变、PCR、电镜、免疫荧光、血凝及血凝抑制、VP2基因序列分析等多种方法进行鉴定，发现分离毒株为new CPV-2b型，这为研制适合延边地区犬细小病毒毒株的疫苗和高免血清以及后续研究提供必要条件。

1 材料与方法

1.1 材料 2016年3月采集自吉林省延边朝鲜族自治州敦化市某肉狗厂病犬。该犬临床表现症状为发热、厌食、呕吐、严重腹泻。采用拭子擦拭病犬肛门处残留排泄物后，将粪便拭子迅速放入每支含有2 mL含有100 IU(μg)/mL双抗的PBS的离心管中，于-80 ℃冻存备用[1-2]。

1.2 细胞系、抗体 猫肾细胞(F81)由本实验室保存，CPV直接免疫荧光抗体，购自VMRD公司。

1.3 主要试剂 胎牛血清、MEM，购自GIBCO公司；Taq酶、dNTP等，购自天根生化科技(北京)有限公司；CPV-a型、CPV-b型单克隆抗体：由实验室制备并保存。

1.4 病料的处理与病毒的分离 将病料反复冻融3次，用无菌镊子将粪便拭子上的液体挤干。 10 000 r/min(4 ℃)离心30 min后，取上清，用0.22 μm滤器过滤，分装到无菌EP管中，冻存于-80 ℃冰箱，备用。采用同步接毒法，将500 μL待分离病毒样品接种于F81细胞。于37 ℃、5%CO2培养箱培养，同时设正常细胞对照。培养期间，每日观察细胞病变(CPE)。连续盲传3代，细胞出现明显CPE，将培养物反复冻融3次，10 000r/min(4 ℃)离心30 min后，取上清，继续接种F81细胞，待F81细胞出现80%～90%CPE时收毒，冻存于-80 ℃冰箱，备用[3]。

1.5 病毒鉴定

1.5.1 形态学鉴定 病毒形态学鉴定采用电镜负染技术对第5代F81细胞培养物进行观察，详细操作方法见文献[4]。

1.5.2 直接免疫荧光试验 在96孔细胞培养板接种F81细胞，同步接种1/10体积的病毒液。培养72 h后，弃去上清，连同正常细胞对照，用PBS洗3次，后加入100 μL预冷(-20 ℃)的80%丙酮固定液，于4 ℃固定30 min，后用PBS洗3次，加入CPV直接免疫荧光抗体，放入避光湿盒内，于37 ℃，反应30 min。[5]

1.5.3 血凝特性鉴定 采用微量血凝及血凝抑制试验对分离毒株的细胞培养物进行分离毒株的血凝特性鉴定。[6]

1.5.4 引物设计、PCR扩增及VP2序列分析 根据GenBank已公布的犬细小病毒序列利用生物学软件设计合成2对引物，1对引物作为犬细小病毒特异性鉴定引物，另1对引物为VP2基因扩增引物。将扩增后的VP2基因做胶回收后克隆于T载体，鉴定后挑选阳性克隆进行测序，将测序结果与参考序列进行分析比对后建立进化树进一步分析。本研究所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，生物学分析软件为MEGA 6.0[7]。

1.5.5 单抗试验 将病毒液分别与等体积的CPV-a型和CPV-b型单克隆抗体混合，于37 ℃中和1 h后，分别接种于F81细胞，于37 ℃ 5%CO2培养4 d。同时设正常细胞、病毒对照。

1.5.6 病毒理化性质鉴定 对所分离病毒的细胞培养物进行理化特性鉴定。分别对病毒的耐热特性、耐有机溶剂特性、耐酸碱特性等进行鉴定。同时每组处理病毒分别设立不作处理的正常对照组，依据处理组及对照组病毒的TCID50的变化为判定标准。

1.5.7 基因分型 对所分离病毒的PCR产物进行回收，并送至上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定，将其核酸序列及推导的氨基酸序列与CPV参考毒株进行比较。

1.5.8 动物回归试验 选择HI抗体≤1∶4的2月龄健康中华田园犬4只，随机分为2组，试验组经口服灌胃途径每只灌服5 mL病毒液(含106.0TCID50/mL病毒)，对照组2只，经相同途径灌服5 mL细胞悬液，分别隔离观察饲养，每天观察症状，并收集粪便检测排毒情况。

2 结果

2.1 病毒分离培养结果 处理过的病料同步接种F81细胞后盲传至第3代，细胞出现拉网、圆缩、脱落等特有病变，继续传代病变更加明显。图1为病变细胞与正常细胞对比图，病变细胞90%出现CPE。见图1。

图1 犬细小病毒CPV-DH-3株感染F81细胞出现CPEA：正常细胞对照； B：病毒感染F81细胞72 h后

2.2 形态学鉴定结果 取分离到的病毒第5代培养物处理后经磷钨酸负染可观察到第5代病毒液中呈现立体对称、圆形、无囊膜，直径约为20 nm左右的实心病毒粒子，见图2。

图2 病毒粒子电镜照片

7

8

2. 3 血凝特性采用微量血细胞凝集试验，采用新鲜的1%猪红细胞悬液，检测分离毒株细胞培养物的血凝特性，每孔中以50%以上红细胞出现凝集时判定为阳性，结果在培养的代细胞培养物中其血凝价在27 ～ 28之间，说明该分离株病毒血凝特性比较稳定。在血凝抑制试验中此病毒均可被CPV 阳性血清所抑制。

2.4 PCR扩增鉴定 分别提取第3代病毒液和正常细胞对照的基因组作为模板和阴性对照，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，结果见图3所示，扩增得到了约为570 bp大小的目的片段，与预期相符。

图3 PCR扩增结果1：阴性对照； 2、3：第3代病毒液； M：Marker DL-2 000

2.5 直接免疫荧光试验 病毒液接种F81细胞72 h后，直接免疫荧光试验结果显示，病毒能够在F81细胞中复制，且病毒主要集中在细胞核，正常细胞对照组未见荧光，见图4。

2.6 VP2序列分析鉴定结果 将第5代细胞培养物提取基因组用VP2序列引物进行扩增后经克隆测序，测序结果表明，分离病毒CPV-DH-3的VP2基因序列包含1 755个碱基，将该病毒的VP2序列与GenBank上已有的犬细小病毒其他参考序列综合比较，做序列同源性分析。通过生物学软件(MEGA 6.0)对分离毒株和参考毒株VP2序列生成的进化树分析可知，分离的CPV-DH-3株病毒与参考序列同源性较高，核苷酸序列及氨基酸序列相似性最高达99%以上。分离毒株CPV-DH-3与我国流行毒株CPV-2b的核苷酸同源性较高达到99.3%，氨基酸同源性高达99.1%。

图4 直接免疫荧光检测病毒感染F81细胞A：细胞培养物荧光染色结果； B：空白对照

图5 序列分析进化树

2.7 分离毒株类型单抗鉴定结果 分离到的CPV-DH-3株病毒和参考毒株在F81细胞上培养72 h并固定后，用特异性单克隆抗体进行免疫组化检测，结果显示，抗CPV-2a型单抗仅与参考毒株反应，而与分离株不反应，抗new CPV-2b型单抗与分离株反应，所以分离株CPV-DH-3毒株为new CPV-2b型。

2.8 病毒理化性质鉴定 将所分离病毒的细胞培养物经20%乙醚、pH值3.0以及56 ℃热处理后与对照组相比病毒活性(TCID50)无明显变化。以上特性符合细小病毒特征。

2.9 病毒分型 对所分离病毒的PCR产物进行回收和序列测定，将其核酸序列及推导的氨基酸序列与CPV参考毒株进行比较。结果显示，CPV-DH-3株与参考株LCPV-V204的碱基顺序和氨基酸顺序一致，因此判断所分离到的CPV毒株为new CPV-2b型(表1、2)。

表1 CPV-DH-3株与CPV参考毒株碱基对比

表2 CPV-DH-3株与CPV参考毒株氨基酸对比

2.10 动物回归试验 人工感染的2只比格犬经过2 d的潜伏期后，在第3天开始出现精神委靡、厌食、排稀便的症状；第5天出现排绿色粪便和血便。试验组两只犬分别在第7天和第8天死亡，剖检呈现消瘦、脱水、肠道出血症状。对试验犬粪便血凝试验结果显示，试验组犬的粪便在第3天开始出现血凝现象，说明试验犬从第3天开始排毒，而对照犬在整个试验过程中，精神、食欲等未见异常变化。

3 讨论

本研究从疑似犬细小病毒感染的犬粪便中分离出一株病毒，后经细胞培养、病毒形态学鉴定、血凝试验、直接免疫荧光试验以及PCR扩增试验和VP2基因分析、分离毒株类型单抗鉴定等多种方法鉴定，确定分离的病毒为犬细小病毒，所属毒株类型为new CPV-2b亚型，并命名为CPV-DH-3。

本试验中，分离病毒的细胞培养物在镜下出现明显且典型的细胞病变；利用细小病毒独特的血凝特性验证分离病毒有血凝特性，血凝试验效价达到27～28，且其血凝特性可被CPV阳性血清特异性抑制，说明分离毒株为犬细小病毒；此外，VP2序列扩增比对结果、单抗对毒株分型鉴定的结果说明分离毒株为犬细小病毒为new CPV-2b亚型；动物回归试验表明，该分离株可导致试验犬表现典型的犬细小病毒感染的症状并伴随死亡，说明该分离株为犬细小病毒强毒株。

犬细小病毒属于细小病毒科细小病毒属成员，该病毒属于细小病毒科细小病毒属的成员在同属中还有猫泛白细胞减少症病毒(felinepanleukopeniavirus, FPLV)和水貂肠炎细小病毒(minkenteritisvirus, MEV)等肉食兽细小病毒CPV、FPLV和MEV三者的基因序列一致性高达98%以上具有紧密的亲缘关系。犬细小病毒在世界范围内广泛传播，不断有新的变异株被发现，目前我国流行多种亚型的CPV毒株，本试验中分离得到的CPV-DH-3属于CPV-2b亚型，从进化树可以看出，我国黑龙江哈尔滨、牡丹江地区、北京地区、武汉、南京等地均有分离到该亚型的毒株。其他亚型在上述地区也有分离到，这表明CPV不同亚型的流行并没有十分严格的地区限制。

吉林省延边州的朝鲜族同胞喜食狗肉，在延边朝鲜族自治州内多地都有大量饲养肉用犬。犬细小病毒作为危害我国养犬业的重要疾病，已经引起人们的高度重视。我国专家学者在犬细小病毒病流行病学、病原学、诊断及预防等多方面进行了大量研究，且已经取得阶段性研究进展。[8]本研究丰富了我国犬细小病毒病流行病学调查资料及毒种资源，针对延边敦化地区犬细小病毒，为了解延边地区犬细小病毒的遗传进化趋势，进一步深入研究CPV的生物学特性，制备更有针对性的地区性疫苗和高免血清以及综合防疫方案的制定，提供了理论依据。

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IsolationandidentificationofCanineparvovirusisolatedfromDunhua

REN Wen-ming1, SUN Ming2, YE Ming3, ZHAO Dan1

(1.Ginseng and Antler Product Quality Supervision, Inspection And Test Center of Jilin Agricultural University,Changchun 130118,China ; 2.Tong hua Center for Disease Control And Prevention in Jilin , Tonghua 134001,China ; 3.Jilin Te Yan Biological Technology Liamited Liability Company, Changchun 130122,China)

The object of the research was to enrich the database for study on the epidemiology of the canine parvovirus in Yanbian and to prepare for research effective vaccines and diagnostic reagents. We collected the suspected canine parvovirus infection disease canine faecal swab in Yanbian Prefecture Dunhua City and infected the feline kidney cells (F81) after pretreatment until the cells appeared obvious specific lesions. The cell culture were examined by morphology, molecular biology and immunology etc. The isolated virus caused cytopathic effects specifically and the virus particle was clearly visible by electron microscopy.The isolated viru agglutinated erythrocyte and the agglutination of erythrocyte was specifically inhibited by positive serum. The infected cell were tested positive by PCR and direct fluorescent staining. Phylogenetic tree of CPV’s VP2 sequences had a highly homologs to type of new CPV-2b. Conclusions: From the results above, we identified the isolated virus as CPV and the CPV belonged to the type of new CPV-2b and was named as CPV-DH-3.

canine parvovirus ; DH-3 ; isolation ; identification

ZHAO Dan

S852.65+9.2

A

0529-6005(2017)09-0034-04

2016-12-09

任谓明(1983-)，男，助理研究员，硕士，从事微生物与生物技术研究工作，E-mail：469577286@qq.com

赵丹，E-mail：469577286@qq.com