甘向东， 李 飞， 蔡 欣， 付文亮， 徐东刚*， 龙民慧

(1. 军事医学科学院基础医学研究所， 北京 100850； 2. 天津科技大学生物工程学院， 天津 300457)

SUMO-1在ApoE-/-小鼠PM2.5暴露中调控血管HIF-1α/VEGF信号通路的研究

甘向东1,2， 李 飞1， 蔡 欣1， 付文亮1， 徐东刚1*， 龙民慧2*

(1. 军事医学科学院基础医学研究所， 北京 100850； 2. 天津科技大学生物工程学院， 天津 300457)

以气管滴注方法研究了ApoE-/-小鼠经PM2.5暴露后，其主动脉弓中SUMO-1、HIF-1α、血管内皮生长因子(VEGF)表达变化规律及HIF-1α的SUMO化修饰情况. 实验结果显示： PM2.5暴露后，小鼠主动脉SUMO-1、HIF-1α、VEGF的表达上调；PM2.5暴露诱导了SUMO-1对HIF-1α的SUMO化修饰； 低氧条件下SUMO-1敲低导致HIF-1α表达的下调. 结果提示PM2.5暴露通过上调细胞中SUMO-1的表达，稳定或者上调HIF-1α的表达，进而影响血管内皮生长因子(VEGF)的表达，造成动脉粥样硬化斑块的不稳定.

PM2.5暴露; SUMO-1; 缺氧诱导因子-1α; 血管内皮生长因子

Keywords： PM2.5exposure; SUMO-1; HIF-1 alpha; Vascular endothelial growth factor (VEGF)

细颗粒物(PM2.5)浓度急剧升高能够引起动脉粥样硬化(AS)斑块不稳定，并增加缺血性心血管疾病等冠脉综合症发病率[1]. 血管的修复和新生是导致斑块稳定性减弱的主要因素[2]. 血管内皮细胞生长因子(VEGF)能够与相应受体结合促进血管内皮细胞增殖、迁移和血管通透性增加来参与血管的修复和新生[3]，提示VEGF可能对AS斑块稳定起了重要的作用. 但PM2.5暴露通过何种途径影响VEGF 表达并导致AS斑块稳定性变差的机制尚未明确. 有研究证实PM2.5进入人体到肺泡后，直接影响肺的通气功能，使机体处在缺氧状态[4]. 机体缺氧状态的应激反应之一就是低氧诱导因子HIF的应答反应和在细胞中积聚[5]. HIF-1是异二聚体的转录因子，由氧敏感的α亚基(HIF-1α)和在核内稳定表达的β亚基(HIF-1β)组成. HIF-1α是功能性亚基，调控VEGF等多种基因的表达，与血管的修复和动脉斑块的稳定性有重要的联系[6]. 因此，HIF-1的稳定性可能是影响斑块稳定性的重要因子. 影响HIF-1稳定性对血管重构和新生引发的AS斑块形成有着重要的意义. 最近几年发现的泛素样蛋白家族成员小泛素蛋白样修饰蛋白-1(SUMO-1)能与HIF-1α共价结合，并对其进行翻译后修饰作用，该过程称为小泛素相关修饰(Small Ubiquitin-related Modifier，SUMO)[7]. SUMO化是一个可逆的动态过程，可被特异性蛋白酶SENP-1将其从底物上去除，此过程称为去SUMO化[8]. 可逆的SUMO化修饰能在低氧下调节HIF-1α的稳定性及转录活性[9]. 本文旨在研究SUMO在PM2.5暴露引发低氧应激过程中对HIF-1α和VEGF表达的影响，探究PM2.5暴露引起AS斑块不稳定导致缺血性心血管疾病发生的可能机制.

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物：ApoE-/-小鼠24只，体质量20～22 g，雄性，10周龄，由北京维通利华实验动物有限公司提供. 实验仪器：颗粒物采样器(Thermo Anderson G- 215，美国热电子公司)；玻璃纤维滤膜(Whatman© 41 filters ，Whatman Inc, Maidstone，UK)；mini-VIDAS-IDAS全自动免疫荧光酶标仪(法国生物梅里埃公司)；DU640型分光光度计(美国Beckman公司)；PAC200型电转印仪与电转印槽(美国BIO-RAD公司)；600PJ型电泳仪与垂直电泳槽(天能公司)；PE2400型PCR扩增仪(PerkinElmer公司)；Mx3000P qPCR Systems(美国安捷伦公司). 实验试剂：Lowry法蛋白含量检测试剂盒(中国凯基生物技术公司)；RIPA裂解缓冲液(Applygen Technologies Inc.China)；PrimerScript Reverse Transcriptase(TaKaRa Biotechnology Co,Ltd.Jan)；GAPDH(中国康为世纪生物公司)；实验细胞系：Ecv304细胞. 胎牛血清(Gibco公司)，DMEM高糖培养基(Gibco公司)；所用抗体：SUMO-1(abcam,Y299)，HIF-1α(abcam,ab16066)，VEGF(abcam,ab46154)；转染SUMO-1的siRNA(上海吉玛制药技术有限公司).

1.2 方法

1.2.1 PM2.5采样及处理 PM2.5采样于2013月12月1号起，采用ThermoAnderson G- 215采样器在北京三环某采样点连续2周采集PM2.5，将载有颗粒物的滤膜剪裁成2 cm2大小，浸入去离子蒸馏水中，超声清洗机中对PM2.5进行洗脱，功率700 W，震荡30 min，震荡液6层纱布过滤，滤液冷冻真空干燥，低温冰箱保存备用.

1.2.2 试验动物分组和染毒 ApoE-/-小鼠在恒温、恒湿二级动物房高脂(含质量分数2%胆固醇和10%脂肪)饲养18周后，将小鼠随机分成3组，PM2.5组、生理盐水组、空白对照组，每组8只. PM2.5染毒剂量为8 mg/kg, 染毒方法为气管滴注，每4 h一次，共3次. 染毒过程没有出现动物死亡情况，最后一次染毒24 h后，每组采集7只小鼠血液，并分离得血清；颈部脱臼处死小鼠，取小鼠主动脉，冻存于液氮罐中.

1.2.3 PM2.5暴露对心肌损伤指标肌酸激酶(Creatine Kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(Creatine Kinase Isoenzyme,CK-MB)、肌钙蛋白(Troponin，CTn-I)的影响 血清中肌钙蛋白CTn-I、肌酸激酶CK及肌酸激酶同工酶CK-MB采用mini-VIDAS-IDAS全自动免疫荧光酶标仪进行检测.

1.2.4 qPCR检测PM2.5暴露对血管SUMO-1、HIF-1α、VEGF转录的影响 RNApure超纯总RNA快速提取试剂盒按说明书操作，小鼠主动脉标本每组取3只，分别提取总RNA，总RNA按1 μg 进行反转录. 转录后的cDNA 用于实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,qPCR)，使用带荧光的MaximaTMSYBR Green/ROX qPCR Master Mix(2×) 在Mx3000P QPCR Systems上进行反应，反应体系50 μL. 分别检测SUMO-1、HIF-1α、VEGF在不同处理组的小鼠血管中表达水平，所需引物序列见表1.

表1 小鼠主动脉qPCR所需引物序列Table 1 Primer sequenles for qPCR in aortic of mice

1.2.5 Western-blot检测PM2.5暴露对血管SUMO-1、HIF-1α、VEGF表达的影响 小鼠主动脉标本加RIPA裂解缓冲液在冰浴条件下匀浆，提取组织总蛋白，并用Lowry法蛋白含量检测试剂盒定量细胞总蛋白. 总蛋白经质量分数12% SDS-PAGE凝胶电泳分离，通过蛋白印迹法转移到孔径为0.2 μm的PVDF膜上. 将PVDF膜在质量分数5% 脱脂奶粉液(溶剂为含体积分数1‰ Tween20的Tris缓冲液，TBS-T)配制成的室温中封闭非特异结合位点1～2 h. 然后用质量分数5% 脱脂奶粉配制的特异性抗体(一抗)SUMO-1、HIF-1α、VEGF，稀释度均为(1∶1 000)，4 ℃过夜孵育PVDF膜，过夜后用TBS-T洗去未结合的抗体，洗3次，每次10 min，再用带有辣根过氧化物酶(HRP)标签的羊抗鼠和羊抗兔的二抗继续室温孵育PVDF膜1 h，接着用TBS-T洗去未结合的二抗，洗3次，每次10 min. 最后用Super Signal West Femto Substrate 处理，暗室中显影. 以GAPDH作为内参.

1.2.6 免疫共沉淀(CO-IP) 取小鼠主动脉标本加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂，冰上研磨后放置30 min，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，收集上清；取1.5 mL离心管，每管加入30 μL ProteinA/G-agarose，加入200 μL RIPA裂解液洗珠子，3 000 r/min、4 ℃离心2 min，用RIPA裂解液洗2次后将上述组织上清液加入到ProteinA/G-agarose管中，4 ℃漩涡混合器上孵育1 h；将该混合物3 000 r/min、4 ℃离心2 min后取上清，各管加入HIF-1α抗体标签1 μg，4 ℃漩涡混合器上孵育4 h，各上清管加入ProteinA/G-agarose 50 μL，4 ℃漩涡混合器上孵育过夜，3 000 r/min、4 ℃离心5 min，小心弃去上清液，加入500 μL的RIPA裂解液重悬ProteinA/G-agarose沉淀，上述步骤重复5次后，彻底吸干裂解液后各样品加入30 μL 2×SDS上样缓冲液，混匀后100 ℃煮10 min，吸取上清，Western-blot检测SUMO-1的表达情况.

1.2.7 qPCR检测低氧对SUMO-1、HIF-1α转录的影响 ECV304细胞培养到对数生长期，细胞以每孔1×105个接种于6孔培养板，37 ℃、CO2体积分数5%培养箱中培养24 h，弃上清，每孔均加入2 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基，根据实验设计加入CoCl2，使其终浓度为300 mmol/L. 培养24 h后，提取总RNA，qPCR检测所需引物序列见表2.

表2 ECV304细胞qPCR所需引物序列Table 2 Primer sequences for qPCR in ECV304 cell

1.2.8 低氧培养ECV304细胞，利用细胞转染siRNA敲低SUMO-1基因 将实验细胞分成对照组和敲低SUMO-1组，按照2.5×105个/孔、体积2 mL接种ECV304细胞于6孔板，并放置于低氧培养箱中12 h后转染，待细胞融合度达80%以上后，使用Lipofectamine2000 (Invitrogen, USA)转染细胞，继续培养24 h 后用于mRNA水平和蛋白水平检测. 用于转染的 siRNA序列分别为：

SUMO-1 siRNA：5′-AACTACATCTTCGTGTACCTC-3′；

NCsiRNA：5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′.

1.3 数据处理及统计学分析

所有数据用均值±方差表示，应用统计软件有SPSS13.0、MxPro3000-qPCR分析软件对数据进行统计分析. 有统计学显著性意义的用*P<0.05和**P<0.01表示. 计量资料进行正态性检验，服从正态分布的进行t检验；偏态分布数据采用Mann-Whitney U检验；检验水准为双侧检验.

2 结果与分析

2.1 PM2.5暴露对血清CK、CK-MB及CTn-I的影响

与空白对照组、生理盐水组相比，PM2.5暴露后的ApoE-/-小鼠血清中CK、CK-MB及CTn-I含量显著性提高(P<0.01)，而生理盐水组小鼠血清中CK、CK-MB及CTn-I含量与空白对照组比较无显著性差异(P>0.05). 结果说明PM2.5暴露影响心肌酶谱的变化，缺血反应发生，心肌出现损伤(表3).

表3 PM2.5暴露对ApoE-/-小鼠血清CK、CK-MB及CTn-I的影响Table 3 Effects of PM2.5 on CK、CK-MB and CTn-I in serum after ApoE-/- mice exposed to PM2.5

注：**表示与空白组相比有显著性差异(P<0.01).

2.2 PM2.5暴露对SUMO-1、HIF-1、VEGF基因转录和蛋白质表达的影响

如图1A所示，ApoE-/-小鼠经PM2.5暴露后主动脉血管SUMO-1、HIF-1α、VEGF转录水平明显上调，生理盐水处理组小鼠与空白组相比无明显变化. 在蛋白水平上进一步研究证实：PM2.5暴露后小鼠血管中SUMO-1、HIF-1α、VEGF的表达水平与其基因转录水平有相似结果(图1B). 说明PM2.5能够上调主动脉SUMO-1、HIF-1α、VEGF等蛋白的表达.

图1 PM2.5暴露对SUMO-1、HIF-1α、VEGF基因转录和蛋白质表达的影响

Figure 1 Effects of PM2.5 exposure on transcription and protein expression ofSUMO-1,HIF-1α andVEGF注：**表示与对照组相比有显著性差异，下图同.

2.3 PM2.5暴露对HIF-1α的SUMO化修饰的影响

ApoE-/-小鼠经PM2.5暴露3次后，每组取2只小鼠主动脉进行研磨，免疫共沉淀结果显示，生理盐水组SUMO-1没有对HIF-1α发生SUMO化修饰，PM2.5暴露后SUMO-1对HIF-1α产生了明显的SUMO化修饰(图2). 本实验中以生理盐水组作为PM2.5组的对照,故没有设置空白对照组，每种处理2个重复.

图2 PM2.5暴露后HIF-1α的SUMO化修饰情况

Figure 2 SUMO modification of HIF-1 alpha after exposure to PM2.5

2.4 低氧处理ECV304细胞后对SUMO-1、HIF-1α转录的影响及敲低SUMO-1对HIF-1α表达的影响

对数生长期的ECV304细胞，经正常培养和低氧培养24 h后qPCR结果可见：低氧上调了ECV304细胞中SUMO-1、HIF-1α基因的表达(图3A)；在低氧培养条件下，敲低SUMO-1蛋白表达后，HIF-1α的表达也受到了抑制(图3B)，这些结果说明HIF-1α的表达受SUMO-1基因的调控.

图3 低氧培养情况下SUMO-1敲低对ECV304细胞中HIF-1α表达的影响

Figure 3 Effects SUMO-1 knockdown on the expression of HIF-1αin ECV304 cells under hypoxia

3 讨论

由于PM2.5暴露直接作用于肺部，引起气道反应，造成呼吸功能减弱，导致机体缺氧发生. 缺氧与许多生理和病理过程密切相关[10]. 细胞对低氧应激的直接反应之一是在细胞内积聚转录因子HIF-1, 在细胞对环境条件的应答调节中发挥重要作用[11]. HIF-1参与细胞内的多种生物学过程, 包括血管生成、能量代谢以及细胞存活等. 而HIF-1需经历翻译后的修饰, 如羟基化修饰、泛素化修饰、乙酰化修饰来调节其稳定性[12]. 有研究表明SUMO-1介导了HIF-1α翻译后的修饰[13]. 另外的研究则认为 SUMO-1 对 HIF-1α的翻译后修饰起稳定作用并上调其表达，增加 HIF-1α的转录活性[14]. HIF-1 稳定性及转录活性增高，增强了 VEGF 的表达，影响血管新生和重构[15]. 因此，本文推测 PM2.5暴露引发肺部和呼吸道反应，造成肺部低氧，进而影响气血循环，并通过上调HIF-1α表达和抑制其降解来调控 VEGF 表达和血管新生，最后导致 VP 形成，这可能是 PM2.5暴露引发急性冠脉综合症的原因之一.

本文利用 ApoE-/- 小鼠证实： PM2.5暴露引起血清中 CK、CK-MB、CTnI 水平显著增高，确实引发了心肌损伤，并且损伤可能是由于心肌缺血所引起的. 不仅如此，文中还检测到 PM2.5暴露后，小鼠血管中 HIF-1α、SUMO-1 转录及表达水平升高，说明 PM2.5暴露引起了机体缺氧的发生，并且血管重构相关的重要因子VEGF表达上调，提示 PM2.5暴露可能引发血管重构.

细胞学实验进一步发现低氧条件下 SUMO-1表达水平升高，同时也证实了HIF-1α的转录水平升高. SUMO-1被敲低后，HIF-1α的表达降低. 这一结果表明SUMO-1可能增强了HIF-1α的表达. 综上所述，PM2.5暴露引起 SUMO-1 表达上调，增强了 HIF-1α/VEGF 通路信号传递，最终导致斑块的不稳定，可能是 PM2.5暴露导致急性冠脉综合症的一个机制.

[1] TONNE C,WILKINSON P. Long-term exposure to air pollution is associated with survival following acute coronary syndrome[J]. European Heart Journal,2013,34(17):1306-1311.

[2] GASPARI T,WELUNGODA I,WIDDOP R E,et al. The GLP-1 receptor agonist liraglutide inhibits progression of vascular disease via effects on atherogenesis,plaque stability and endothelial function in an ApoE(-/-) mouse model[J]. Diabetes and Vascular Disease Research,2013,10(4):353-360.

[3] ROCHA S F,SCHILLER M,JING D,et al. Esm1 modulates endothelial tip cell behavior and vascular permeability by enhancing VEGF bioavailability[J]. Circulation Research,2014,115(6):581-590.

[4] SCHWEL A D. Air pollution and health in urban areas[J]. Reviews Environ Health,2000,15(1/2):13-42.

[5] RABINOWITZ M H. Inhibition of hypoxia-inducible factor prolyl hydroxylase domain oxygen sensors:tricking the body into mounting orchestrated survival and repair responses[J]. Journal of Medicinal Chemistry,2013,56(23):9369-9402.

[6] WU Y,LUCIA K,LANGE M,et al. Hypoxia inducible factor-1 is involved in growth factor,glucocorticoid and hypoxia mediated regulation of vascular endothelial growth factor-A in human meningiomas[J]. Journal of Neuro-Oncology,2014,119(2):263-273.

[7] WANG Q,XIA N,LI T,et al. SUMO-specific protease 1 promotes prostate cancer progression and metastasis[J]. Oncogene,2013,32(19):2493-2498.

[8] BETTERMANN K,BENESCH M,WEIS S,et al. SUMOylation in carcinogenesis[J]. Cancer Letters,2012,316(2):113-125.

[9] MESSNER S,SCHUERMANN D,ALTMEYER M,et al. Sumoylation of poly(ADP-ribose) polymerase 1 inhibits its acetylation and restrains transcriptional coactivator function[J]. The FASEB Journal,2009,23(11):3978-3989.

[10] MANRESA M C,GODSON C,TAYLOR C T. Hypoxia-sensitive pathways in inflammation-driven fibrosis[J]. American Journal of Physiology Regulatory Integrative and Comparative Physiology,2014,307(12):1369-1380.

[11] SHIMODA L A,LAURIE S S. HIF and pulmonary vascular responses to hypoxia[J]. Journal of Applied Physiology,2014,116(7):867-874.

[12] AHN G O,SEITA J,HONG B J,et al. Transcriptional activation of hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1) in myeloid cells promotes angiogenesis through VEGF and S100A8[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2014,111(7):2698-2703.

[13] CHAN J Y,TSAI C Y,WU C H,et al. Sumoylation of hypoxia-inducible factor-1 α ameliorates failure of brain stem cardiovascular regulation in experimental brain death[J]. PLoS One,2011,6(3):e17375.

[14] SHAO R,ZHANG F P,TIAN F,et al. Increase of SUMO-1 expression in response to hypoxia:direct interaction with HIF-1alpha in adult mouse brain and heart in vivo[J]. FEBS Letters,2004,569(1/2/3):293-300.

[15] CURY V,MORETTI A I,ASSIS L,et al. Low level laser therapy increases angiogenesis in a model of ischemic skin flap in rats mediated by VEGF,HIF-1α and MMP-2[J]. Journal of Photochemistry and Photobiology B,2013,125:164-170.

HIF-1α/VEGF Signal Pathway Regulated by SUMO-1 in Vessel after ApoE-/- Mice Exposed to PM2.5

GAN Xiangdong1,2, LI Fei1, CAI Xin1, FU Wenliang1, XU Donggang1*, LONG Minhui2*

(1. Laboratory of Genomic Engineering, Beijing Institute of Basic Medical Sciences, Beijing 100850，China;2. College of Bioengineering, Tianjin University of Science and Technology, Tianjin 300457，China)

To evaluated the regulation of SUMO-1 to HIF-1αand vascular endothelial growth factor (VEGF) in ApoE-/- mice after PM2.5exposure by intratracheal instillation method, the SUMOylation of HIF-1αby SUMO-1, the expressions of SUMO-1, HIF-1α, and VEGF were investigated. After PM2.5exposure, the expressions of SUMO-1, HIF-1α, and VEGF in mouse aorta were up-regulated remarkably. PM2.5exposure induced SUMO-1 mediated SUMOlytion of HIF-1α. The expression of HIF-1αwas down-regulated bySUMO-1 knockdown under hypoxia. These results suggest that PM2.5exposure up-regulates the expression of SUMO-1 and stabilizes or up-regulates expression of HIF-1α, then upregulates the expression of VEGF, causing the unstablility of atherosclerotic plaques.

2015-12-31 《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

国家重点基础研究计划(973)项目(2011CB503803)；国家自然科学基金项目(81170255,31271476)

*通讯作者:徐东刚，研究员，Email:xudg@bmi.ac.cn;龙民慧，副研究员，Email:longminhui2006@126.com.

R318

A

1000-5463(2017)05-0054-05

【中文责编：成文 编辑助理：冷佳奕 英文审校：李海航】