●黄静

质粒DNA的转化、提取及酶切分析

●黄静

目的：构建人Bcl-2基因原核表达载体，并对其酶切鉴定。方法：将Bcl-2重组质粒转化进入经CaCl2法制备的大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选培养充分克隆，然后用碱裂解法分离提取重组质粒DNA，最后用限制性内切酶酶切重组质粒DNA，并跑电泳鉴定。

人Bcl-2基因；质粒转化；CaCl2法；质粒提取；碱裂解法；酶切分析

本研究介绍人Bcl-2重组质粒DNA的转化、分离提取和内切酶酶切鉴定。

1 材料与方法

1.1 试剂

不含氨苄青霉素的LB液体培养基、含氨苄青霉素的LB液体培养基、100mg/ml氨苄氨基酸溶液、人Bcl-2重组质粒、大肠杆菌DH5α、75%乙醇；碱裂解法试剂溶液Ⅰ、溶液Ⅱ、溶液Ⅲ，氯仿、异丙醇、蒸馏水；限制性内切酶EcoR1及其缓冲液、1×TAE电泳缓冲液、SYBRGreen荧光染料、DNAMaker。

1.2 仪器和器材

加样枪、枪尖、EP管、玻璃涂布器、恒温水浴箱、超净工作台、恒温摇床、恒温培养箱、电泳装置、紫外成像仪。

1.3 方法

CaCl2法、碱裂解法、DNA限制性内切酶酶切分析法。

2 实验操作

2.1 质粒转化

（1）制备新鲜感受态DH5α大肠杆菌（实验前已经制备好）。

（2）DNA重组子的转化大肠杆菌DH5α，如表1操作：

表1 DNA重组子的转化大肠杆菌DH5α

2.2 质粒DNA分离提取

（1）用接种针调琼脂平板中单菌落于盛有2mlLB液体培养基(含100µg/mlAmp)的试管中，37℃摇荡培养过夜。

（2）取菌液1ml收集在1.5ml的EP管中，10000r/min离心2min，吸弃上清，将离心管倒置于一纸巾上，以使所有液体流出。

（3）在沉淀中加入溶液Ⅰ250µl，涡旋混匀，静置5min。

（4）加入新鲜配置的溶液Ⅱ250µl，颠倒5次，溶液变透明、粘稠。

（5）加入溶液Ⅲ350µl，颠倒混匀，溶液出现白色沉淀。

（6）12000r/min离心2min，将上清转移至吸附柱中。

（7）10000r/min离心30s，弃滤液。

（8）向吸附柱中加洗脱液500µl，10000r/min离心30s，弃滤液。

（9）将吸附柱换到另一新EP管中，在吸附柱中央加buffer缓冲液20µl，10000r/min离心1min，弃吸附柱，得质粒DNA分离液。

2.3 DNA限制性内切酶酶切分析

（1）在质粒DNA分离提取液中依次加入下列试剂：灭菌的双蒸水11µl，缓冲液 2µl，20U/µlEcoRI2µl，质粒 DNA 样品 5µl，加至 200µlEP 管中，反应总体积20µl，加盖，混匀后稍离心，37摄氏度水浴反应1h。

（2）配置琼脂糖凝胶，并灌胶。

（3）加样：取6×载样缓冲液5µl加入经酶切后的EP样品管中，轻轻混匀，用微量移液器取15μl样品加到凝胶点样空中，每排孔需加一份DNAMake做对照。

（4）接通电泳槽电源，跑电泳。

（5）跑胶完毕，在紫外成像仪观察结果。

3 实验结果

3.1 质粒转化结果

实验组培养基上生长有大量单个白菌斑，阴性对照组培养基上没有菌落生长，阴性对照组培养基所加感受态细菌是不含人Bcl-2重组质粒的，表明感受态细菌本身没有含抗Amp基因，其在加Amp的平板上不能生长，感受态细菌也未被杂菌污染，而实验组中人Bcl-2重组质粒成功转化DH5α。

3.2 质粒DNA提取和酶切结果

重组质粒DNA提取产物的酶切电泳结果显示，电泳图中1号加样孔出现两条条带，条带1为pBS(2.96kb)条带，条带2为目的Bcl-2(1.9kb)条带，条带2比较模糊，条带1相对清晰。

4 讨论分析

4.1 质粒转化结果分析

（1）实验组与对照组不同在于实验组加入了人Bcl-2重组质粒[1]，人Bcl-2重组质粒中带有抗Amp基因，故实验组中人Bcl-2重组质粒转化DH5α工程菌能在含Amp的培养基上生长，而对照组加入的为无重组质粒的新鲜感受态DH5α细菌，细菌不能存活。

（2）实验组菌落生长分布比较均匀，说明涂平板时也图得比较均匀；菌落大小均一，生长状况也一致，未发现杂菌菌落，结合对照组中无菌落生长，表明感受态细菌未被杂菌污染[2]。

4.2 质粒DNA提取和酶切结果

从大肠杆菌细胞中分离提取质粒DNA对接下来的酶切非常重要，提取到的质粒DNA量太少或质量太差都可能在酶切后跑不出条带。加入溶液Ⅱ这一步比较关键。

（作者单位：安徽医学高等专科学校）

[1]张泉,朱鸿飞,于可响,薛方明,孙怀昌.重组大肠杆菌碱裂解方法的改进[J].中国生物工程杂志,2007,27(2):80-81.

[2]刘卫今,蒋勇,完迪迪.简单高效的感受态细胞制备和质粒转化体系的建立[J].安徽农业科学,2008,36(7):2745-2746.