●李广意 赵娟

阿魏酸钠对MCAO小鼠脑缺血再灌注损伤神经细胞保护作用

●李广意 赵娟

目的：观察阿魏酸钠对MCAO小鼠缺血再灌注损伤的保护作用Caspase-3表达的影响。方法：采用线栓法阻塞小鼠大脑中动脉（middlcerebralartery,MCAO）建立局灶性脑缺血实验模型，观察阿魏酸钠（sodium ferulate,SF）灌胃及脑缺血再灌注损伤后小鼠的神经行为学评分及脑梗死体积的影响；分别采用TTC染色、FJB染色细胞凋亡的数量改变。结果：TTC染色显示空白组未见脑梗死灶,模型对照组、阿魏酸钠组脑梗死体积百分比分别有改善。FJB结果显示细胞凋亡减少。结论：阿魏酸可降低神经细胞的损伤，降低细胞凋亡的发生，并可通过抗氧化和抗凋亡作用协同起到保护作用。

缺血再灌注；阿魏酸；脑梗死率

由于老龄化人口的增加，脑血管病的发病率急剧增高，脑血管疾病也是危害人类健康的主要疾病之一[1],在脑血管性疾病当中又以缺血性血管疾病最为常见,深入了解缺血性脑血管疾病的病理生理基础过程及其临床表现是正确预防和治疗脑血管性疾病的前提[2]，根据脑缺血发生的原因不同可以分为脑血栓形成,脑栓塞及血液动力学障碍引起的脑缺血.根据脑缺血的严重程度可分为完全性脑缺血和不完全性脑缺血(脑供血不足).充分认识脑血管病的严重性，提高脑血管病的治疗与预防水平、降低脑中风的发病率、致残率和死亡率是当务之急[3]。

1 材料和方法

1.1 药品与试剂

健康昆明小鼠（湖南期莱克景达实验动物公司）提供，TTC（2,3,5—氯化三苯基四氮唑）购自南京建成科技有限公司，阿魏酸(sodiumferulate SF)购自aladdin industrial corporation。用生理盐水配制成阿魏酸钠。

1.2 实验动物分组及给药方法

分组与模型制备：健康昆明小鼠60只，体重为（28±5）g，雄性，随机分为3组，即假手术组、模型对照组、阿魏酸钠组(5ml/kg)、每组20只，模型进行后神经行为学评分分；脑梗死体积的测定；小鼠造模2h后灌胃，灌胃量均为5ml/kg，2次/d，连续7d，而模型对照组给予等体积生理盐水。

1.3 动物模型制备过程

动物模型制备：取长2cm鱼线,在距一端0.7cm处做一标记。采用线栓造模方法并进行部分改良[1]，具体操作步骤如下：用三溴乙醇和阿托品对小鼠进行腹腔注射麻醉，仰卧位固定，再在颈部正中切口。用镊子剥离右侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）。假手术正常组即到此为止。分别用弹性橡皮阻断CCA和 ECA主干的近心端，阻断血流，同时在CCA处留一根手术线以备用。在ECA近CCA分叉口处用银针扎一小口，将预先处理过的鱼线插入,用镊子轻轻将鱼线沿ECA、ICA，送入大脑中动脉（MCA）起始部，直至感觉有轻微阻力时停止，此时大脑中动脉主干血流已经中断。用手术线扎紧以固定鱼线。此时鱼线插入深度约为0.7cm。用100w的灯泡照射小鼠以保持体温。缺血1h后，将鱼线拔出，恢复血流，实现缺血再灌注。术毕缝合颈部皮肤。

1.4 造模成功指标

待小鼠麻醉清醒后，用按照Longada等的五分制评分标准进行分级评分；无明显神经损伤症状为0分，不能完全伸展对侧前爪为1分，向对侧转圈为2分，向对侧倾倒为3分，不能自发行走、意识丧失为4分。1-3分者则为造模成功，留用。0分或4分者则为造模不成功。

2 结果

2.1 造模结果

各组小鼠均出现右侧Horner征；左侧前肢不能前伸，爬行时向左侧倾倒或向左侧转圈；排除0分、4分的小鼠，将神经功能缺损评分为1-3分的小鼠保留，纳入统计分析。

2.2 对小鼠脑梗死体积的影响

表1 各组小鼠神经功能评分、脑梗死体积的比较(n=10,x±s )

2.3 TTC染色观察梗死体积

图1 生理盐水组

图2 阿魏酸钠组

2.4 FJB染色

图1 生理盐水组

图2 阿魏酸钠组

3 结论

在实验过程中我们发现，动物的体重应选择在25g以上健康的小鼠。缩短手术时间和准确掌握鱼线进位深度和角度是模型成功的关键，该法操作相对简便，节省了时间。并在Zea Longa法介绍[4]的线栓造模方法进行改良，采用弹性橡皮阻断CCA 血流，减少对血管的损伤。同时采用银针扎口，使血管开口口径小而明显，便于鱼线插入。手术会导致动物活动次数减少、饮食困难，进而使小鼠死亡率上升。在术后给小鼠灌以葡萄糖水，以及时补充能量，提高术后小鼠的存活率。海马是认知、学习功能的重要脑区，又是脑缺血时损伤最敏感部位[5]。如果能提高SF的浓度，增加其在海马中的含量，将大大有助于SF发挥中枢神经的保护作用。本实验通过神经学评分SF对神经损伤的保护作用，结果显示，阿魏酸钠组灌胃7d后具有明显的促进脑缺血后神经功能恢复的作用，并能明显减小脑梗死体积，对小鼠神经损伤均能起保护作用，其改善缺血再灌注后脑组织梗死神经功能损伤的机制可能与清除氧自由基有关。

（作者单位：长沙医学院科研实验中心）

[1]廖维靖,刘淑红,范明,等.线栓阻断大鼠总动脉制作缺血性脑损伤模型的改良[J].中华物理医学与康复杂志,2002,24(6):345-348.

[2].Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without eraniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1);84-91.

[3]李广意,曾杰,赵娟等小鼠活体灌注显示细微脑血管的方法[J].解剖学杂志,2013,36(3):20.

[4]迪丽努尔·沙比托夫,朱毅忠红花黄色素对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用[J].中国中医药信息杂志,2006,13(2):128.

[5]周琴,廖维靖,杨万同等阿魏酸钠促进局灶性脑缺血再灌注后神-血管生成作用的研究[J].中国康复医学杂志,2006,21(3):33.

李妍

李广意（1977～），女，实验师，研究方向为神经解剖学。

湘财教指〔2015〕54号15C0146长医研[2014]2号KY201440

湘财教[2014]85号14C0130