郑捷 方庆全 高德宏

冷冻切片固定质量影响因素的探讨

郑捷 方庆全 高德宏

目的探讨影响冰冻切片固定质量的因素。方法收集2016年1—12月厦门大学附属第一医院病理科的80例冷冻切片标本，每例标本连续切片7片，随机分为7组，A组电吹风快速吹干切片，B组立即放入95%乙醇固定1 min，C组立即放入10%中性福尔马林固定1 min，D组立即放入丙酮固定1 min，E组立即放入AAF液固定1 min，M组立即放入AAF液固定15 s，N组立即放入AAF液固定30 s。固定后染苏木素、水洗、分化、返蓝、染伊红、脱水、透明、封固等，比较各组的脱片情况、染色结果。结果A组未发现脱片现象，B、C、D、E组出现脱片的数量分别为15片、12片、24片和13片。将B组未脱片的65例编成F组，将C组未脱片的68例编为G组，将D组未脱片的56例编为H组，将E组未脱片的67例编为I组，比较A、F、G、H、I五组染色情况，I组组织清晰的切片比例明显高于A、F、G和H组（P均＜0．05）；在细胞皱缩度方面，与I组比较，F组、H组细胞均出现明显皱缩现象（P均＜0．01）；I组的细胞核染色鲜艳度和核浆对比度均明显优于其他四组（P均＜0．05）。比较 M、N和I组的染色情况，染色效果从优到劣依次为I组→N组→M组。结论AAF是一种较为理想的冰冻切片固定液；影响冰冻切片固定质量的因素包括固定液的种类、冷冻组织的类别、固定时间的长短等。

冷冻切片；固定；质量；影响因素

快速将组织冷冻成一定的硬度，切出薄片的过程，称冷冻切片[1]。冷冻切片技术在病理诊断中具有举足轻重的作用[2-3]，常用于临床手术科室快速组织学诊断，在手术进行当中取出病变组织，要求病理医师在很短的时间内做出良、恶性的诊断，为临床医师下一步的手术方案与治疗提供指导[4]。因此，制作一张高质量的冷冻切片对术中病理诊断极其重要，而固定是其中非常关键的环节。作者通过对比实验，探讨冷冻切片固定质量的影响因素。

1 材料与方法

1.1 材料

收集2016年1—12月厦门大学附属第一医院病理科的80例冷冻切片标本，其中乳腺组织35例、甲状腺组织25例、肺组织5例、卵巢组织10例、淋巴结5例。

1.2 设备

冷冻切片机为德国Microm HM525冷冻切片机。

1.3 试剂

新配制的Harri苏木素染液，95%乙醇，10%中性福尔马林，丙酮，AAF液（由95%乙醇A：乙酸A：甲醛F = 85：5：10组成）。

1.4 取材与切片

按常规取材、速冻、冷冻切片[1]，每例连续切片7片，随机组成7组切片。

1.5 固定

7组冷冻切片分别按以下方法处理：A组：电吹风快速吹干切片，B组：立即放入95%乙醇固定1 min，C组：立即放入10%中性福尔马林固定1 min，D组：立即放入丙酮固定1 min，E组：立即放入AAF液固定1 min，M组：立即放入AAF液固定15 s，N组：立即放入AAF液固定30 s。

1.6 染色

切片固定（A组电吹风快速吹干）后放入已预热的苏木素中染色1 min，水洗、分化、返蓝、染伊红、脱水、透明、封固，显微镜下观察。

1.7 观察指标

以组织清晰度、细胞皱缩度、细胞核染色、核浆对比度四项为评价指标，显微镜下观察比较不同固定方法下冷冻切片的染色效果。

1.8 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计数资料用百分率（%）表示，行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 脱片情况比较

A组未发现脱片现象，B、C、D、E四组均出现不同程度的组织脱片。B、C、D、E组出现脱片的数量分别为15片、12片、24片和13片。

2.2 染色结果比较

将B组未脱片的65例编成F组，将C组未脱片的68例编为G组，将D组未脱片的56例编为H组，将E组未脱片的67例编为I组，比较A、F、G、H、I五组染色情况见表1。

表1 5种不同固定液固定下冷冻切片HE染色结果（n / %）

由表1可见，I组组织清晰的切片比例明显高于A、F、G和H组（χ2= 6.45、4.06、5.25、17.46，P均＜0.05）。在细胞皱缩度方面，与I组比较，F组、H组细胞均出现明显皱缩现象（χ2=27.00、34.68，P均＜0.01）。I组的细胞核染色鲜艳度和核浆对比度均明显优于其他四组（χ2=8.84、5.30、6.63、16.50，5.43、4.34、5.40、13.73，P均＜0.05）。

2.3 固定时间长短比较

比较 M、N和I组的染色情况，M组：五种组织均结构模糊，细胞核肿大，细胞核染色差，核浆对比度差。N组：乳腺、肺、卵巢三种组织固定效果较 M组明显改善，甲状腺、淋巴结组织无改善。I组：五种组织固定效果均佳。

3 讨论

随着医学技术的发展，冷冻切片得到了广泛应用[5-6]。冰冻切片由快速切片、快速固定、快速染色三部分组成[7]，在短时间内制作一张高质量的切片要注意的细节很多，固定质量的好坏对切片质量有极大的影响。

固定液的选择很大程度上影响固定的质量。常用的固定液有95%乙醇、10%福尔马林、丙酮、AAF液等。朱小兰等[8]发现，95%乙醇属沉淀类固定剂，对组织脱水、收缩作用明显，使细胞核保存不够清晰，核着色不良，细胞会出现明显皱缩现象。10%福尔马林对组织具有较强的穿透能力，对组织无明显收缩作用，但无法消除因冷冻引起的细胞内液的肿胀，因此染色易导致细胞核模糊、对比度不佳。而且甲醛固定需要 10 min 以上，影响冷冻切片的出片速度[9]。丙酮是易燃易挥发气体，渗透力强，但对肝、肾组织固定效果欠佳，常被误诊为组织自溶，且丙酮固定使组织收缩剧烈，易脱片。AAF液是一种复合型固定液，其中乙醇、甲醛有较好的固定作用，而乙酸能使组织膨胀，可抵偿因乙醇、甲醛固定引起的组织收缩和硬化，三种固定液的混合使用固定效果达到最佳。另一影响固定质量的因素是放入固定液中的固定时间。以AAF液为例，放置1 min组织固定效果比放置15 s、30 s更好。

综上所述，AAF是一种较为理想的冰冻切片固定液，影响冰冻切片固定质量的因素包括固定液的种类、冷冻组织的类别、固定时间的长短等。

[1] 丁伟，王德田． 简明病理学技术[M]． 杭州：浙江科学技术出版社，2014：46．

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[4] 王德田，董建强． 实用现代病理学技术[M]． 北京：中国协和医科大学出版社，2013：80．

[5] 张红红． 冷冻切片与术中细胞学诊断卵巢肿瘤的对比研究[J]． 中国卫生标准管理，2016，7（11）：185-186．

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[7] 刘宪军． 固定时间对乳腺癌快速冰冻切片免疫组化结果的影响[J]．当代医学，2013，19（30）：8-9．

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如何编写参考文献

列出参考文献的目的，在于引证资料（包括观点、方法等）的来源，不可从别人的论文中转抄过来。内部资料，非经正式发表者，一般不作文献引用，要求引用文献者必须用阅读过的、重要的、近5年文献为准。论著10条左右，论著摘要3～5条，综述20条左右。

Discussion on the Factors Influencing the Fixation Quality of Frozen Section

ZHENG Jie FANG Qingquan GAO Dehong Department of Pathology, The First Affiliated Hospital of Xiamen University, Xiamen Fujian 361003,China

ObjectiveTo investigate the factors affecting the fixation quality of frozen section.Methods80 cases of frozen sections from the First Affiliated Hospital of Xiamen University were collected from January to December 2016. Each specimen was serially sectioned into 7 slices, randomly divided into 7 groups: A group, quickly drying slice with hair dryer. B group, immediately placed in 95% ethanol to fix 1 min. C group, immediately placed in 10% neutral formalin to fix 1 min. D group,immediately placed in acetone to fix 1 min. E group, immediately placed in the AAF liquid to fix 1 min. M group, immediately placed in the AAF liquid to fix 15 seconds. N group, immediately placed in AAF liquid to fix 30 seconds. After fixation, the process of dyeing hematoxylin, washing,differentiation, returning blue, dyeing eosin, dehydration, transparency,sealing and so on, were carried out according with the unified procedure.The results of the unfalling and staining of each group were compared.ResultsNo stripping was found in the A group. The number of stripping in B, C, D and E group was respectively 15, 12, 24 and 13. 65 cases of no stripping in B group were incorporated into F group. 68 cases of no stripping in C group were incorporated into G group. 56 cases of no stripping in D group were incorporated into H group. 67 cases of no stripping in E group were incorporated into I group. The staining of five groups of A, F, G, H and I were compared. The number of clear tissue slices in I group was significantly higher than that of A, F, G and H group (P ＜0.05); In the aspect of cell shrinkage, compared with I group, the cells in F group and H group showed obvious shrinkage phenomenon (P ＜ 0.01);The nuclear staining brightness and contrast caryoplasm in I group were significantly better than the other four groups (P ＜ 0.05). The staining of M,N and I group was compared, the dyeing effect from priority to inferiority were I group, N group and M group.ConclusionAAF is an ideal fixation fluid for frozen section. The factors affecting the quality of frozen section include the types of the fixation liquid, the types of frozen tissue, the length of the fixation and so on.

frozen section; fixation; quality; influencing factor

R365

A

1674-9316（2017）22-0127-03

10．3969/j．issn．1674-9316．2017．22．063

厦门大学附属第一医院病理科，福建 厦门 361003

方庆全