不同条件制配鸡红细胞悬液对血凝-血凝抑制试验影响初探

2017-10-24颉煦泽景强强王希彩关文怡北京农业职业学院北京房山102442

山东畜牧兽医 2017年10期

姜聪颉煦泽景强强王希彩关文怡（北京农业职业学院北京房山 102442）

姜聪颉煦泽景强强王希彩关文怡（北京农业职业学院北京房山 102442）

新城疫血凝-血凝抑制(HA-HI)试验是免疫检测最常用的方法之一，本试验旨在探究不同条件下制备1%鸡红细胞悬液对血凝-血凝抑制试验结果的影响。试验表明，母鸡红细胞悬液相对于同品种公鸡对新城疫抗原更敏感；在紧急大量检测新城疫样品时，可以采集鸡心脏血进行快速大量制备HA-HI试验所需的红细胞悬液；1%～1.5%浓度范围的鸡红细胞悬液对HA试验是有效的，但要注意判读误差。

鸡红细胞悬液血凝血凝抑制新城疫

有许多病毒能够凝集某些动物和人的红细胞，故可以此来检测待检材料中有无病毒的存在。而能凝集红细胞的病毒，其凝集性可被相应的抗体所抑制，这种抑制具有特异性，故病毒的血凝集抑制试验可用标准病毒悬液检查被检血清中的相应抗体，也可用特异性抗体鉴定新分离的病毒[1]。新城疫血凝-血凝抑制试验是动物疫病检疫，是免疫检测最常用的方法之一。本试验根据《新城疫诊断技术》(GB/T16550-2008)[2]标准来进行不同条件制配鸡红细胞悬液对血凝-血凝抑制试验影响对比初探，为新城疫血凝-血凝抑制试验检测提供参考。

1 设备与材料

1.1 设备

普通离心机(型号TDZ4A，湘仪离心机仪器有限公司生产)、微型振荡器(型号MH-2，海门市其林贝尔仪器制造有限公司生产)、DRAGON微量移液器。

1.2 试剂

鸡新城疫标准阳性血清(北京中海生物科技有限公司，批号20160517)、鸡新城疫标准抗原(北京中海生物科技有限公司，批号20160520)、鸡新城疫标准阴性血清(北京中海生物科技有限公司，批号20160601)、待检血清(自配)、3.8%柠檬酸钠溶液(自配)。

2 方法与步骤

2.1 红细胞悬液的配制

2.1.1 1%鸡红细胞悬液配制分别从健康成年鸡翅静脉、单只健康成年免疫公鸡(翅静脉、心脏)采集2.5ml抗凝血液，于各自相对应离心管中，加入四倍体积的生理盐水混匀，以2000r/min离心5min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤3次(第3次离心8min)，吸取0.2ml压积红细胞加入19.8ml生理盐水混匀，配成相对应体积分数为1%鸡红细胞悬液[2]。

2.1.2 不同浓度鸡红细胞悬液配制从健康成年非免疫公鸡翅静脉采集2.5ml抗凝血液，于离心管中，加入四倍体积的生理盐水混匀，以2000r/min离心5min，去掉血浆和白细胞层，重复以上过程，反复洗涤3次(第3次离心8min)，按0.25%(吸取0.25ml压积红细胞加入99.75ml生理盐水混匀)、0.5%、0.75%、0.8%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、1.8%、2%，配成相对应体积分数的鸡红细胞悬液[3]。

2.2 试验设计

2.2.1 以不同采血方式分组通过《新城疫诊断技术》(GB/T16550-2008)血凝-血凝抑制试验测定同种抗原/血清的血凝-血凝抑制滴度[4]，每组做待检血清50份。分组见表1。

表1 血凝-血凝抑制试验分组

2.2.2 配制不同浓度鸡红细胞悬液通过《新城疫诊断技术》(GB/T16550-2008)血凝试验测定同种抗原的血凝滴度：将非免疫公鸡红细胞悬液配制成0.25%、0.5%、0.75%、0.8%、1%、1.25%、1.5%、1.75%、1.8%、2%的浓度，做HA试验测定同种抗原的血凝滴度，每组做待检血清50份。

2.3 试验方法

2.3.1 HA试验判定抗原血凝价（1）取96孔V型血凝反应板，用微量移液器在1～12孔每孔加0.025ml生理盐水；（2）吸取0.025ml的待检抗原加入第1孔中，吹打4次混匀混合液，从第1孔中吸取0.025m L混合液于第2孔，依次倍比稀释到第11孔，从第11孔吸取0.025ml混合液弃去，设第I2孔为生理盐水对照；（3）每孔各加入0.025ml生理盐水；（4）每孔各加入0.025ml鸡红细胞悬液；振荡混匀混合液，室温22℃下静置约40 min，观察结果；（5）结果判断：在生理盐水对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否完全凝集。以使红细胞完全凝集的病毒最大稀释度为该抗原的血凝滴度，红细胞完全凝集的病毒的最高稀释倍数为1个血凝单位(HAU)。

2.3.2 HI试验测定被检血清的抗体效价（1）取96孔V形微量反应板，用移液器在第1孔～第11孔各加入0.025ml生理盐水，第12孔加入0.05ml生理盐水。（2）在第1孔加入0.025ml被检血清，吹打4次混匀混合液，吸取0.025ml混合液于第2孔，依次倍比稀释到第10孔，从第10孔吸取0.025ml混合液弃去，第11孔为病毒对照，第12孔为生理盐水对照。并设新城疫标准阴性血清对照、阳性血清对照。（3）在第1孔～第11孔各加入0.025ml 4HAU抗原，振荡混匀混合液，室温下22℃静置30min。（4）每孔加入0.025ml1%鸡红细胞悬液，振荡混匀混合液，室温22℃下静置约40min观察结果。（5）结果判定：在对照孔出现正确结果的情况下，将反应板倾斜，观察红细胞是否呈泪珠状流下。血凝抑制滴度是指红细胞产生完全不凝集(红细胞完全流下)的病毒最高稀释度。（6）本次试验的阴、阳性血清HI滴度应与已知滴度相差在1个相对应滴度范围内，并且所用阴、阳性血清都不发生自凝[4]。

3 结果与分析

本试验数据统计均采用EXCEL软件进行t检验，统计结果用“平均数±标准误”表示。（1）根据试验记录，公鸡和母鸡红细胞悬液对抗体之间的差异显著性进行t检验，分析结果见表2。

表2 海蓝褐蛋公鸡、母鸡红细胞悬液对抗体指标分析 (log)

表2可见，海蓝褐蛋公鸡、母鸡红细胞悬液抗体水平差异极显著(P＜0.01)，因此海蓝褐单只健康成年鸡的性别不同，其配制的1%鸡红细胞悬液对鸡新城疫HA-HI试验的检测结果是有区别的，免疫公鸡静脉1%鸡红细胞悬液测得HI试验比母鸡高，免疫母鸡静脉血相对于同品种免疫公鸡对新城疫病毒更敏感，建议在同等条件下优先考虑使用母鸡血进行血凝-血凝抑制试验的检测[7]。（2）根据试验记录，对静脉和动脉抗体之间的差异显著性进行t检验，分析结果见表3。

表3 海蓝褐蛋鸡静脉、动脉红细胞悬液对抗体指标分析 (log)

表3可见，海蓝褐蛋鸡静脉、动脉红细胞悬液对抗体指标上，抗体水平差异不显著(P＞0.05)，建议在紧急大量测待检样时可以采用鸡心脏采血这种快速采血方式[8]。（3）用健康成年单只笼养与散养免疫公鸡1%红细胞悬液进行血凝试验，测定的抗原血凝效价按《新城疫诊断技术》(GB/T16550-2008)标准来判读是一致的，但是仔细观察，新城疫抗原对其两种红细胞的凝集能力还是有区别的，即散养免疫公鸡效价判读孔中的判读点要大于笼养公鸡。用健康成年单只笼养与散养免疫公鸡翅静脉1%红细胞悬液进行血凝抑制试验，测定血清的血凝效价按《新城疫诊断技术》(GB/T16550-2008)标准来判读，散养鸡红细胞测得的血凝效价比笼养鸡高出一个滴度效价数为20组(47.6%)，血凝效价相等为22组(52.4%)。综上说明笼养免疫公鸡静脉血相对于同品种散养免疫公鸡对新城疫病毒更敏感，建议在同等条件下优先考虑使用笼养免疫公鸡血进行血凝-血凝抑制试验的检测。（4）用制备的单只健康非免疫成年公鸡翅静脉血的不同浓度红细胞悬液，进行血凝试验(HA)，发现0.25%鸡红细胞悬液对血凝试验无结果，0.5%鸡红细胞悬液测得血凝试验比0.75%高出1个滴度，比1%高出2个滴度，比1.25%高出2个滴度，比1.5%高出2个滴度。因此，低于0.8%鸡红细胞悬液对血凝试验是有影响的，1%%～1.5%鸡红细胞悬液对血凝试验结果没有影响，但随着上述鸡红细胞悬液浓度增大，其反应孔中的反应液愈加浑浊，很容易影响判读结果。建议在配制红细胞悬液时，浓度不要低于1%，但也不能过高，不能超过1.5%。