樊雪梅 王书民 李哲建 贾雪艳 郑行望

摘要利用AuNPs/Nafion复合膜技术固定Ru（bpy）2+3，采用羧基化碳纳米管固定氨基化腺苷适配体，制备腺甘电化学发光生物传感器。采用循环伏安法和电化学发光法对传感器进行表征。结果表明，此传感器具有良好的稳定性和重现性。腺苷与传感器作用后，腺苷与其适配体形成G四面体结构，Ru（bpy）2+3的电化学发光强度降低。在最佳实验条件下，电化学发光强度降低量与腺苷浓度的负对数在1.0×10

Symbolm@@ 11～1.0×10

Symbolm@@ 7 mol/L范围内呈良好的线性关系，线性方程为ΔIECL=

Symbolm@@ 890lgC-5050，检出限（S/N=3）为5.0 × 10

Symbolm@@ 12 mol/L。对1.0 × 10

Symbolm@@ 10 mol/L腺苷平行测定11次，相对标准偏差为2.7%。用于尿液中腺苷的测定，加标回收率在 97.1%～110.0%之间。

关键词电化学发光； 腺苷适配体； 腺苷

1引 言

腺苷是一種遍布人体细胞的内源性核苷，是合成三磷酸腺苷、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体， 可直接进入心肌， 经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还可扩张冠脉血管，增加血流量[1]。另外，大量研究表明， 尿腺苷可作为肿瘤的潜在生物标志物，在广谱性癌症诊断、手术疗效评价中具有重要临床实用价值[2]。因此对腺苷的分析检测具有重要的理论和实用意义。目前，测定腺苷的方法有色谱法[3]、化学发光法[4]、荧光法[5，6]、电化学法[7～9]等。

适配体是利用体外筛选技术指数富集的配体系统进化技术，从核酸分子文库中得到的寡核苷酸片段，能与多种目标物质高特异性、高选择性的结合[10]。 Sun等[11]利用外切酶Ⅲ辅助的DNA循环和杂交链反应的双重放大作用，构建了一种免标记荧光适配体传感器用于检测腺苷。Sun等[12]利用适配体探针与捕获探针发生杂交，腺苷与适配体之间的特异性结合将适配体探针从双链中置换下来，导致传感界面上双链数量减少，从而使吸附的亚甲基兰数量相应减少，建立了一种电化学适配体传感器检测腺苷的方法。Wang等[13]构建了以腺苷适配体、二硫苏糖醇和巯基己醇为组成的三元模式电化学阻抗腺苷适配体传感器，并用于腺苷的检测。电化学发光（ECL）是指一些中间体，主要是自由基离子在电的激发下产生于电极表面，继而进行高能电子迁移反应，形成激发态而产生的一种发光现象[14]。电化学发光生物传感器是将生物分子固定在电极上，并将生物识别分子和目标分析物结合的生物信号转换为可检测的ECL信号的一种分析器件。三联吡啶钌是目前研究最为广泛的电化学发光活性物质，然而，它本身没有可用于标记的活泼基团，常常通过衍生物或以纳米粒子为载体而实现标记[15]。目前，利用ECL适配体传感器检测腺苷已有报道，如孙波等[16]将捕获探针通过与酰胺氯交联共价键合到修饰了对氨基苯磺酸的石墨电极表面，设计了一种基于夹心式检测腺苷的ECL适配体传感器。Lin等[17]建立了基于硅纳米粒子对联吡啶钌电化学发光信号放大作用的腺苷适配体ECL传感器。Li等[18]利用Rusilica 纳米材料的 ECL 信号高以及 Ru（bpy）2+3二茂铁体系的猝灭效率高的优点，建立了一种信号闭合型ECL 腺苷适配体传感器。Chen等[19]利用含有RuSi NPs和腺苷适配体片段的ss DNA1与二茂铁标记的 ss DNA2 互补杂化，腺苷与腺苷适配体特异性结合，使得标记有猝灭剂的腺苷适配体从电极上脱落，使得 ECL 信号得到恢复，建立了检测腺苷的新方法。但上述几种方法各有缺点， 如操作复杂、线性范围较窄或检出限较高等。

本研究制备了AuNPs/SWCNTs/Nafion复合膜，Ru（bpy）2+3通过静电吸附固定于复合膜上，腺苷适配体与SWCNTs通过酰化反应固定于AuNPs/SWCNTs/Nafion/Ru（bpy）2+3上，制备得到ECL适配体生物传感器， 此传感器具有良好的稳定性和重现性。 腺苷与传感器作用后，腺苷与腺苷适配体形成G四面体结构，导致Ru（bpy）2+3远离电极表面，电化学发光强度降低，从而实现腺苷的定量检测。本方法与文献报道的ECL方法比较，具有操作简单、线性范围宽等优点。

2实验部分

2.1仪器和试剂

MPIE型电致化学发光分析系统（西安瑞迈电子科技有限公司）；Zennium电化学工作站（德国Zahner公司）； UV1600PC 紫外可见分光光度计（上海美谱达仪器有限公司）；JEM2100型透射电子显微镜（日本电子株式会社）；RT5 POWER电磁搅拌机（德国IKA公司）；WF300D超声波清洗机（宁波海曙五方超声设备有限公司）；TDL802B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；PTRO 10L实验室超纯水设备（上海品拓环保工程设备有限公司）。采用三电极系统：工作电极为裸玻碳电极或修饰电极，Pt丝为对电极，Ag/AgCl电极（饱和KCl 溶液）为参比电极。

腺苷适配体序列（5′ AGA GAA CCT GGG GGA GTA TTG CGG AGG AAG GT （CH2）7NH23′），根据文献[20]设计，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。羧基化单壁碳纳米管（SWCNTs，中国科学院成都有机化学有限公司，COOH含量2.73%，长度5～30 μm，纯度>90%）。三联吡啶钌、Nafion、N羟基琥珀酰亚胺（NHS）、1（3二甲氨基丙基）3乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）和氯金酸（Sigma公司）。腺苷（上海生工公司）。其它试剂均为分析纯，实验用水为超纯水。

1.0 × 10

Symbolm@@ 4 mol/L腺苷适配体溶液的配制： 腺苷适配体于12000 r/min离心8 min后，以29 μL 0.1 mol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4）溶解。1.0 × 10endprint

Symbolm@@ 4 mol/L腺苷溶液的配制：准确称取0.0010 g腺苷溶于10 mL 0.1 mol/L PBS缓冲溶液。 5 mmol/L [Fe（CN）6]3

Symbolm@@ /4

Symbolm@@ 0.10 mol/L KCl（0.10 mol/L PBS，pH=7.4）溶液；50 mmol/L TPA（0.1 mol/L PBS，pH=7.4）溶液；5 mg/mL NHS和2 mg/mL EDC溶液（0.10 mol/L PBS，pH=7.4）；0.01 mol/L Ru（bpy）2+3溶液；氯金酸：0.01%；柠檬酸三钠：1%。冲洗液为0.01 mol/L PBS缓冲溶液（pH 7.4）。

2.2纳米金的制备

采用柠檬酸钠还原法制备纳米金[21]。于250 mL锥形瓶中加入100 mL 0.01% 氯金酸溶液，加热至沸， 加入2.75 mL 1%柠檬酸钠溶液，继续煮沸12 min，颜色由紫红色变为酒红色，停止加热，自然冷却至室温。将此溶液装入棕色瓶置于4℃保存。

2.3电化学发光生物传感器的制备

将玻碳电极（直径2 mm）在0.05 μm三氧化二铝抛光粉上打磨光亮，分别在硝酸（1∶1， V/V）、 乙醇（1∶1， V/V）、 超纯水中超声3 min，干燥。AuNPs/SWCNTs/Nafion溶液的制备：准确称取5 mg SWCNTs溶于5.0 mL 0.5% Nafion溶液中，超声分散30 min，得到 1 mg/mL SWCNTs/Nafion分散液，将 SWCNTs/Nafion分散液和AuNPs溶液按体积比1∶1混合，超声分散30 min，即得到AuNPs/SWCNTs/Nafion溶液。取10 μL AuNPs/SWCNTs/Nafion混合液涂滴于预处理好的玻碳电极表面，自然晾干，再滴加10 μL 1.0 mmol/L Ru（bpy）2+3于修饰好的电极上，自然晾干后得到Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/Nafion 修饰电极，将此电极浸泡于2 mg/mL EDC和5 mg/mL NHS的混合溶液30 min，以活化SWCNTs中的羧基，然后滴加10 μL 1.0 × 10

Symbolm@@ 5 mol/L 腺苷适配体，自然晾干后用PBS冲洗电极，得到Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/Nafion/腺苷适配体ECL生物传感器，于4℃避光保存。

2.4实验方法

将ECL生物传感器浸入到100 μL含不同浓度的腺苷溶液中反应30 min，随后用PBS冲洗液冲洗电极表面，以0.1 V/s的扫速在50 mmol/L TPA（0.1 mol/L PBS，pH = 7.4）溶液中使用循环伏安法检测。根据ECL强度的减少值（ΔI = I0-IS）对腺苷进行测定（IS是ECL生物传感器检测腺苷的发光强度值，I0是ECL生物传感器的空白值）。所有实验均在室温下进行。

3结果与讨论

3.1纳米金粒子的表征对制备的纳米金进行了吸收光谱和透射电镜表征。由图1可知，纳米金最大吸收波长为521 nm，这是球形纳米金粒子表面等离子吸收的特征峰。如图1B所示，纳米金粒子的平均粒径约为20 nm，且分散效果良好。

3.2传感器检测腺苷原理

Ru（bpy）2+3和AuNPs/SWCNTs/Nafion通过静电吸附固定于玻碳电极表面，腺苷适配体与SWCNTs通过酰化反应固定于AuNPs/SWCNTs/Nafion/Ru（bpy）2+3上，从而制备得到ECL适配体生物传感器。 当加入目标物腺苷时，适配体与腺苷结合， 形成G四链体，导致Ru（bpy）2+3远离电极表面，从而引起ECL信号的降低。传感器检测腺苷原理见图2。

出现了明显的ECL现象，这表明Ru（bpy）2+3已固定在AuNPs/SWCNTs/Nafion/GCE表面，并表现出良好的ECL行为。将腺苷适配体修饰在Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/Nafion/GCE上后，ECL信号明显降低， 表明腺苷适配体已固定在Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/ Nafion/GCE表面。 图3C为Ru（bpy）2+3/AuNPs/SWCNTs/Nafion/腺苷适配体/GCE连续扫描10圈得到的ECL图，连续扫描10圈过程中，ECL变化很小，表明修饰电极具有良好的稳定性。

3.4电化学发光生物传感器的可行性

对ECL适配体传感器与腺苷相互作用前后的发光强度进行了考察（图4）。由图4可知，传感器与腺苷作用前电化学发光峰强度为6012（曲线a），当与1.0 × 10

3.5实验条件的选择

考察了体系的pH值及腺苷与传感器作用时间对ECL强度的影響。由图5A可知，随反应时间的增加，ECL强度的降低值ΔI逐渐增大，到30 min时ΔI趋于平稳，再继续增加结合时间，ΔI几乎不变，因此选择30 min作为反应结合时间。pH对ECL强度有一定的影响[24]。由图5B可知，随着pH值增大，腺苷对传感器上钌的ECL信号抑制程序逐渐增大，当pH=7.4时，抑制程度达到最大。因此选择pH 7.4的缓冲溶液进行实验。

3.6干扰实验

在优化实验条件下，考察实际样品中可能存在的物质对腺苷测定的影响。当腺苷浓度为1.0 × 10

7.4）. （a）blank， （b）1.0 × 10

3.8传感器的重现性和稳定性分析

用同一支传感器对 1.0 × 10

Symbolm@@ 10 mol/L腺苷连续测定11 次，电化学发光强度相对标准偏差为2.7%， 用同一批次的5 支传感器对1.0 × 10endprint

Symbolm@@ 10 mol/L腺苷進行测定，电化学发光强度相对标准偏差为2.9%，说明此传感器有较好的重现性。为考察传感器的稳定性，使传感器吸附一定浓度的腺苷后， 于4℃下保存，定期测定电化学发光信号值，发现电化学发光强度相比于原始发光强度，降低了2.6%，说明传感器的稳定性较好。

3.9尿液样品分析

取6份新鲜尿液（陕西省商洛市中心医院提供），用0.01 mol/L pH 7.4的PBS溶液稀释100倍作为分析试样，按照实验方法进行测定，同时，进行加标回收实验，测定结果见表2。加标回收率为97.1%～110.0%， RSD为2.5%～3.5%，表明本方法可用于临床实际样本的检测。

4结 论

制备了一种检测腺苷的电化学发光适配体传感器。首先，Ru（bpy）2+3与AuNPs/SWCNTs/ Nafion 通过静电作用固定于玻碳电极表面，然后采用羧基化碳纳米管固定氨基化腺苷适配体，制备得到ECL生物传感器。当腺苷与传感器作用后，腺苷与腺苷适配体形成G四面体结构，导致发光强度降低。本传感器制备方法简单、用样量少， 用于腺苷的检测，结果令人满意。与文献报道的ECL方法相比，本方法线性范围较宽。本研究为生物小分子的检测提供了一种新思路。

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Determination of Adenosine Based on Ru（bpy）2+3/AuNPs/

SWCNTs/Adenosine Aptamer Electrochemiluminescence Sensor

FAN XueMei*1， WANG ShuMin1， LI ZheJian1， JIA XueYan2， ZHENG XingWang3

1（College of Chemical Engineering and Modern Materials， Shangluo University， Shangluo 726000， China）

2（School of Chemistry and Chemical Engineering， Northwest Normal University， Lanzhou 730070， China）

3（School of Chemistry and Chemical Engineering， Shaanxi Normal University， Xi'an 710062， China）

AbstractBased on the AuNPs/Nafion composite membrane technology and immobilization of amino adenosine aptamer using carboxyl carbon nanotubes on the surface of a glassy carbon electrode， a electrochemiluminescence sensor was preparated. The sensor was characterized by cyclic voltammetry and electrochemical luminescence. The result showed that the sensor had a good stability and reproducibility. Adenosine and adenosine aptamer could form Gtetrahedral structure， leading a decrease of ECL intensity. Under the optimum experimental conditions， the relative ECL intensity showed a good linear relationship to the negative logarithm of adenosine concentration in the range of 1.0×10

This work was supported by the National Natural Science Foundation of China （No. 30970696）.

第45卷2017年9月 分析化學 （FENXI HUAXUE）研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry 第9期1360～1366

[BW（B（S*3/4，0，）][CD44][BW）]

DOI： 10.11895/j.issn.02533820.170256endprint