李媛媛+马玉龙+李娇

摘要：采用自制的负载纳米碳（CNPs）的亲水色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm 粒径，10 nm 孔径），建立了亲水作用液相色谱法（HILIC）测定板蓝根配方颗粒中腺苷含量的方法。结果表明：腺苷浓度在 2.5～20.0 μg/mL时，腺苷浓度与亲水作用液相色谱法测定的峰值线性关系良好，平均回收率97.63%，RSD=4.08%（n=9）。所建立的亲水作用液相色谱法分离效果好、快速简便、准确，结果可靠，可为进一步完善板蓝根颗粒制剂的质量控制标准提供依据。

关键词：亲水作用液相色谱；板蓝根颗粒；腺苷；方法学验证

中图分类号： O655；O657.7+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）06-0284-03

收稿日期：2013-09-29

基金项目：宁夏大学科学研究基金（编号：ZR1207）。

作者简介：李媛媛（1980—），女，宁夏中宁人，博士，讲师，主要从事天然植物和药物有效成分的分析与分离研究工作。E-mail：liyy@nxu.edu.cn。板蓝根颗粒为板蓝根单味药材水提醇沉加工而成，具有清热解毒、凉血利咽之功效[1]。板蓝根配方颗粒作为防病治病的物质载体，是一个极其复杂的混合物体系，其主要化学成分有：靛蓝、靛玉红、丁香酸、喹唑酮酸、精氨酸等[2]。目前，中国药典对板蓝根的现行标准只检测告依春。有报道采用测定靛蓝或靛玉红的含量来控制其质量[3]，由于板蓝根颗粒采用水提醇沉工艺，而靛蓝或靛玉红为脂溶性成分，因此靛蓝或靛玉红含量的多少难以客观、准确地表征该制剂的内在质量。已有研究结果表明，板蓝根配方颗粒中水溶性核苷类成分——腺苷也是板蓝根中抗病毒的活性成分之一，具有抗凝血、扩张冠状动脉、松弛支气管平滑肌、镇静中枢神经和抗心率不齐的作用，并且其含量能够反映板蓝根中核苷类的含量水平，可以作为评价板蓝根配方颗粒的一种指标[4]。

关于核苷类物质含量测定的常用方法是RPLC法和CZE法，但是RPLC只是依靠单一的疏水作用力来实现物质的分离，对极性物质无法保留或者保留很弱。虽然可以使用正向色谱来分析，但是正相色谱通常使用非极性的溶剂做流动相，极性的分析物很难溶解于非极性的流动相，而且与质谱也不兼容。因此，极大的限制了正相色谱的应用。亲水作用色谱（HILIC），是一种新型的色谱模式。类似于正相色谱，在亲水色谱柱上，极性化合物有强保留。不同之处在于，正相色谱所使用的非极性流动相体系被水和有机溶剂的体系所代替。这样就可以解决极性和亲水性分析物在正相色谱体系中不溶解的问题，并且与质谱也有好的兼容性[5-7]。亲水作用色谱，作为对反相色谱的补充和正相色谱的替代，已经显示出巨大的优越性和潜力，成为分析极性和亲水性化合物的一种强有力的色谱技术[8-9]。

目前，使用亲水作用色谱检测板蓝根中腺苷含量未见报道。本研究在自制的亲水作用色谱柱上，固定相以硅胶为载体，负载纳米碳（CNPs）作为固定相[10]，应用HILIC法测定板蓝根中腺苷含量，为完善板蓝根的质量标准提供依据。

1材料与方法

1.1材料

色谱分析在瓦里安高效液相色谱仪 （Varian，美国） 上完成。仪器由2台 Prostar 210型高压梯度泵、1个77251型进样阀（配备20 μL进样环）、1台Prostar 325型紫外检测器和1套色谱数据分析系统（Starws）组成。超声清洗器购买于昆山禾创超声仪器有限公司。

试验过程中使用的超纯水均来自MILLI-Q超纯水系统（Millipore，Bedford，MA，美国）。高效液相色谱仪器的流动相为乙腈 （色谱级，迪马科技，美国） 和超纯水的混合物，流动相和测试化合物在使用前均使用0.45 μm的过滤膜过滤。对照品腺苷购买于国药集团化学试剂有限公司。板蓝根颗粒1袋（10 g），市售。

1.2腺苷保留行为考察

在HILIC中，流动相的洗脱强度对极性和亲水性化合物的保留有最大的影响，因为随着流动相极性的减小，亲水作用逐渐增强。如图1所示，当流动相中乙腈含量从50%增加到80%时，腺苷的保留值逐渐增加。当乙腈含量增加至80%以上时，腺苷的保留值显著增加，这主要受亲水作用控制，是典型的HILIC 的特征。当流动相中乙腈含量小于50%时，化合物的保留随着流动相中乙腈含量的减少而增加，这主要受疏水作用控制。当流动相中乙腈含量为50% 时，分析物在固定相上的保留是最弱的，这是RPLC和HILIC两种色谱模式的分界线。因为当乙腈含量为50% 时，水和乙腈都在固定相表面达到饱和，液液分配作用或者吸附作用都是最弱的。类似的“U”形保留曲线，在许多亲水固定相上观察到[11-12]，这是混合保留模式的典型特征。

1.3色谱条件

色谱柱为自制的固载CNPs的硅胶柱（150 mm×4.6 mm，5 μm 粒径，10 nm 孔径）；流动相为乙腈-水（90 ∶10，体积比）；流速1.0 mL/min；室温；检测波长 254 nm。在此条件下，样品中腺苷与其他组分获得了满意的分离效果，分离结果见图2。

2结果与分析

2.1腺苷浓度与色谱峰面积的线性关系

精确称取腺苷对照品10 mg，置10 mL容量瓶中，以乙腈-水（50 ∶50，体积比）溶解，定容，摇匀即得腺苷对照品贮备液。再分别精确量取对照品贮备液 25、50、75、100、125、150、175、200 μL置10 mL量瓶中，用 50%乙腈稀释至刻度，摇匀，分别吸取10 μL 注入液相色谱仪，测定峰面积值，并以对照品的浓度 X（μg/mL）与峰面积Y（mAU）进行线性回归，得回归方程：Y=2.643×105X-1.454×105，r=0.999 1。说明腺苷浓度在 2.5～20.0 μg/mL时，液相色谱测定的峰面积值与腺苷浓度线性关系良好。endprint

2.2腺苷提取方法

分别精确称取同一批号的板蓝根颗粒3份各1.0 g，分别加超纯水、50%乙腈、20% 乙腈适量，超声溶解，再分别加入上述溶剂至刻度，摇匀，用微孔滤膜过滤，进样。结果表明超纯水提取最完全，含腺苷最高。然后再分别精确称取同一批号的板蓝根颗粒3份各1.0 g，加入超纯水10 mL，分别超声提取40、60、80 min，提取结束后，加超纯水补足，过滤，取滤液检测。腺苷的提取量随超声提取时间增加而增多，但到60 min后提取效率不再增加，因此，板蓝根颗粒采用超纯水超声处理 60 min 提取腺苷。

2.3精密度

取腺苷对照品溶液10 μL，进行亲水作用液相色谱法测定，重复进样5次，结果表明，RSD为1.69%。表明仪器精密度良好。

2.4稳定性

取板蓝根颗粒样品，研细，精确称取适量（约1.0 g）置 10 mL 量瓶中，加适量水，超声处理60 min，摇匀，加水至刻度，0.45 μm的微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。精确吸取同一供试品溶液，分别在0、2、4、8、12 h进样，结果显示，RSD为1.24%，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.5重现性

精确称取同一批号的板蓝根颗粒5份，约每份1.0 g，制备供试品溶液，测定腺苷含量，RSD为3.94%（n=5），表明该方法重现性良好。

2.6回收率

精确称取已知腺苷含量的供试样品9份，每份约0.5 g，分别精确加入腺苷对照品溶液。由表1可知，腺苷平均回收率为97.63%。表1腺苷回收率测定结果

编号板蓝根颗粒

（g）板蓝根颗粒中腺苷量

（μg/mL）加入腺苷对照品量

（μg/mL）测得量

（μg/mL）回收率

（%）RSD

（%）10.499 96.6695.00011.82103.0020.500 86.6815.00011.70100.4030.500 06.6705.00011.72100.9040.501 26.68610.00015.7690.7150.502 06.69710.00016.1694.6660.499 66.66510.00016.6499.8170.501 66.69116.00022.4298.2880.500 46.67516.00021.6293.3990.501 66.69116.00022.2897.42平均97.634.08

2.7样品含量测定结果

分别对不同厂家生产的板蓝根颗粒进行亲水作用液相色谱法测定，结果（表2）表明，不同厂家生产的板蓝根颗粒中腺苷含量差异很大，即使是同一厂家生产的不同批次的板蓝根颗粒之间也存在较大差异。因此，板蓝根制剂的批次间稳定性有待提高，以保障板蓝根临床用药的疗效。

表2亲水作用液相色谱法测定的板蓝根颗粒中腺苷含量

厂家板蓝根取样量

（g）腺苷测得量

（μg）腺苷含量

（μg/g）A0.999 3289.030289.23B0.999 1220.630220.83C1.000 6133.490133.41D（Ⅰ）1.006 3105.750105.09D（Ⅱ）1.000 925.46125.438D（Ⅲ）0.999 575.13175.168

3结论

腺苷为板蓝根配方颗粒中的活性成分之一，由于板蓝根颗粒大部分是水溶性，常用的RPLC法对于一些强极性和水溶性物质无法保留，或者需要使用高的缓冲浓度。本试验首次使用亲水作用色谱法，在低的缓冲浓度体系中，对板蓝根颗粒中腺苷含量进行了测定。为了更好地控制该制剂的质量，采用自制的固载 CNPs 的硅胶固定相，对其中水溶性成分腺苷作为含量测定的指标成分。结果表明：HILIC法是一种适用于强极性和强亲水性样品定性定量分析的可靠手段，该方法方便快捷，测定结果准确、可靠、重现性好，可为进一步完善该制剂的质量控制标准提供依据。

参考文献：

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