张宁



高效液相色谱法测定鸡肉中磺胺类药物研究

张宁

（天津市兽药饲料监察所，天津300402）

建立了鸡肉中磺胺类药物残留的高效液相色谱法（HPLC）测定方法，试验以乙腈提取均质后的鸡肉样品中的磺胺类药物为测试对象，提取液用Sep-Pak氧化铝柱净化，采用高效液相色谱-紫外紫外检测器，以乙腈-甲醇-水-乙酸（2∶2∶9∶0.2，v/v）为流动相，流速为1.0 mL/min，检测波长270 nm。结果表明，磺胺类药物在0.1～5.0 μg/mL范围内，峰面积与浓度呈良好地线性关系，其相关系数均大于0.999 6，检测限为0.05 μg/kg，定量限为0.5 μg/kg。磺胺类药物在0.05、0.20、0.50 μg/kg浓度添加水平上，其回收率在60%～100%（=7）范围内，批内、批间相对标准平均偏差小于15%。本方法与传统方法相比，在检测速度和检测定量上有很大提升。

鸡肉；Sep-Pak氧化铝柱；高效液相色谱；磺胺；残留分析

磺胺类药物是一类广谱抗菌药物，具有性质稳定、产量大、品种多样、价格低廉、使用简便、供应充足等优点，兽医临床上主要用于预防和治疗微生物感染，但磺胺类药物易引起人过敏性反应，甚至有致癌性。随着社会的发展，广泛使用磺胺类药物会造成动物性食品中药物的残留、污染生态环境并对人类健康构成潜在威胁。磺胺类药物残留问题越来越受到人们的关注[1]，是人类亟待解决的问题之一。因此，必须监控各种动物源性食品中该类药物的残留，且建立可靠的分析方法来监测这些药物残留。

根据农业部畜牧兽医局关于修订兽药残留检测方法的精神，由中国兽医药品监察所依据中华人民共和国农业部公告第235号《动物性食品中兽药最高残留限量》[2]及农业部农发[2003] 1号关于发布《兽药残留试验技术规范（试行）》通知的规定[3]及相关试验结果编制起草了有关标准，并根据农业部公告第235号对鸡肉组织中磺胺的最高残留限量进行了规定。本研究在传统方法的基础上，建立了一种快速检测鸡肉组织中磺胺类药物残留的方法，为临床快速准确测试提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

磺胺类药物标准品：磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嗪、磺胺喹噁啉、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺地索辛，均购自德国Adlershof GmbH公司，纯度均≥99.0%；

乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）（美国Fisher公司）；无水硫酸钠、乙酸、正己烷、正丙醇均为优级纯（天津大茂试剂公司）；纯水由美国Millipore超纯水仪制备。

1.1.2 试剂配制

1.1.2.1 混合标准储备液配制

分别精密称取磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪、磺胺甲噁唑、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶各10 mg，置于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解后稀释至刻度，浓度为1 mg/mL，置-20 ℃保存，有效期为6个月。

1.1.2.2 混合标准工作液配制

准确量取1 mL浓度为1 mg/mL的标准储备液置10 mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，浓度调整为10 μg/mL的标准工作液，置-20 ℃保存，有效期为1个月。

1.1.3 主要仪器

高效液相色谱仪（美国安捷伦公司 Agilent1200（配紫外检测器）；电子天平AT261型（瑞士梅特勒公司）；高速冷冻离心机（美国赛墨-飞世尔公司）；涡动混合仪IKA MS3 basic（瑞士万通公司）；振荡器TARGIN VX-Ⅲ（安简（北京）科技有限公司）；固相萃取柱：Sep-Pak氧化铝柱12cc（2 g），购自Waters公司。

1.2 方法

1.2.1 样品提取

称取鸡肉样品5 g（精确到0.01 g），加入乙腈25 mL，无水硫酸钠4 g，匀浆后，以3 000 r/min的速度离心5 min。分离后的残渣再加入25 mL乙腈，振荡10 min后转移至250 mL分液漏斗中，加入正己烷30 mL，振摇5 min，取下层液体，转入250 mL鸡心瓶中，加入正丙醇10 mL，在50 ℃下减压干燥，残留物用95％乙腈3 mL溶解，备用。

1.2.2 样品净化

将以上样品过Sep-Pak氧化铝柱（不需要控制流速）。用95％乙腈5 mL过柱，不收集，再用70％乙腈10 mL洗脱后，向洗脱液中加入5 mL正丙醇，50 ℃下减压干燥，残留物用1.0 mL流动相溶解，过0.22 μm滤膜，待测。

1.2.3 色谱操作参数设定

色谱柱：C18250 mm×4.6 mm（i.d），粒径5 μm；流动相：乙腈-甲醇-水-乙酸（2∶2∶9∶0.2，v/v）；流速：1.0 mL/min；进样量：50 μL；检测波长：270 nm；柱温：30 ℃。

1.2.4 标准曲线的绘制

分别准确量取适量标准溶液，用流动相稀释成浓度为0.1 μg/mL、0.2 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、10.0 μg/mL的标准溶液，供高效液相色谱分析。以各色谱峰峰面积为纵坐标，对照溶液浓度为横坐标，从低浓度到高浓度依次测定，每一个浓度进样3次，按照其所得峰面积的平均值与相对应的标准溶液浓度作标准曲线，计算回归方程和相关系数。

1.2.5 回收率和精密度的测定

采取标准添加法，精密称取匀浆后的鸡肉组织，置于50 mL离心管中，分别添加0.05、0.20、0.50 μg/kg药物浓度，每一种浓度5个样品，重复3次，按照1.2.2和1.2.3项的方法处理后，供HPLC测定，外标法定量，计算回收率、批内、批间变异系数。

-试样中磺胺类药物的残留量（μg/kg）；

-试样溶液中对应的磺胺类药物的浓度（μg/mL）；

-试样总体积（mL）；

-组织样品的重量（kg）。

1.2.6 检测限及定量限的测定

对标准工作溶液，进行HPLC分析，并逐渐降低浓度进样，以溶液检测限的信噪比（S/N）分别大于或等于3和10作为药物的检测限及定量限。计算药物定量限浓度的回收率、批内和批间相对标准偏差，并验证可靠性[4]。

2 结果与分析

2.1 色谱分离条件

根据优化的色谱条件，测定鸡肉组织中的磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪、磺胺甲噁唑、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶。结果显示色谱峰峰形良好，峰间隔时间长，能够实现基线分离，空白样品在上述条件无干扰峰出现（图1、图2、图3）。

图1 鸡肉中磺胺类药物的对照品色谱图

图2 鸡肉中磺胺类药物的空白色谱图

图3 鸡肉中磺胺类药物添加样品色谱图

2.2 绘制标准曲线

分别以磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪、磺胺甲噁唑、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶的色谱峰面积与其相对应的标准溶液的浓度作图，得到系列标准曲线（图4），图4显示磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪、磺胺甲噁唑、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶在0.1～5.0 μg/mL的浓度之间，峰面积与浓度呈现良好的线性关系。

图4 标准曲线图

2.3 样品的回收率及精密度

由表1看出，鸡肉组织中添加浓度分别50、200、500 μg/kg时，回收率为70.3%～93.5%，批内、批间RSD分别低于8.8%、5.1%。表明该方法可靠且重复性好。

表1 鸡肉样品中7种磺胺类药物回收率（n=7）

2.4 灵敏度

用本试验建立的检测方法，测定7种磺胺类药物的检测限和定量限，分别为0.05 μg/kg（S/N≥3）0.5 μg/kg（S/N≥10）。由表1可见，添加浓度为50 μg/kg时，该磺胺类药物的平均回收率均大于70.3%，批内、批间RSD分别低于8.8%、5.1%，表明该方法在定量限上可靠且灵敏度高，完全满足鸡肉组织中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪、磺胺甲噁唑、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶的残留检测需要。

3 讨论

磺胺类药物因其具有广谱抗菌、价格低廉等特点，被广泛应用于兽药临床和畜牧业中。针对目前动物性食品中磺胺类药物检测存在样品前处理繁琐、检测仪器昂贵、试剂用量大、费用高等问题，急需建立快速简便、灵敏度高的多残留同步确证定性定量分析方法[5-7]。

3.1 流动相选择

用甲醇、乙腈、冰醋酸和其他常用溶剂，采用不同比例的多溶剂体系进行预试验，结果显示，磺胺喹噁啉组分出峰慢且有拖尾现象，说明这些溶剂体系不适合作为流动相。考虑到磺胺类药物结构式中带有氨基，有弱碱性，其中性分子和离子形式的分配性质在有机相和水相中有所不同，因此，在反相液色谱条件下，以含水相作为流动相，调节含水相的pH值，抑制弱碱的解离，进而改变保留行为。弱碱的保留性随着含水流动相pH值的降低而减少。本研究考虑添加1.5%乙酸作为流动相，改善磺胺喹噁啉保留值和色谱峰形。选用甲醇增加流动相强度，以甲醇-15%乙酸进行不同比例洗脱试验，最终选择乙腈-甲醇-水-乙酸的配比为2∶2∶9∶0.2。

3.2 提取溶剂的选择

鸡肉组织中磺胺类药物残留检测常用的溶剂有乙腈、乙酸乙酯。用乙酸乙酯提取时因其沸点较高，磺胺类药物又耐热性较差，因此，浓缩温度不宜过高。由于浸出的杂质也较多，过Sep-Pak氧化铝固相萃取柱后仍有基质干扰。

结合试验，选择用乙腈能除去鸡肉组织中的脂类物质，再加入正己烷，由于乙腈与正己烷之间能实现液-液分层，将底层转入至250 mL鸡心瓶中，为防止50 ℃下减压干燥时爆沸，加入5 mL正丙醇，残留物用95％乙腈3 mL溶解，最后用1.0 mL流动相定容残渣。该方法浸出的杂质少且容易排除基质干扰，效果理想。

3.3 固相萃取柱的选择

单纯的液-液萃取很难排除色谱分析时的基质干扰，经过大量筛选，最后选用Sep-Pak氧化铝萃取柱（二乙烯基苯-N-乙烯基吡咯烷酮共聚物）进行试验，净化效果理想，除杂效果好，回收率高且重现性好。

3.4 检测波长

磺胺类药物有较强的紫外吸收，本研究综合考虑7种磺胺类药物的紫外吸收光波长，选择最佳波长为270 nm。

4 结论

本研究建立了高效液相色谱测定鸡肉中磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺喹噁啉、磺胺甲氧嗪、磺胺甲噁唑、磺胺地索辛、磺胺二甲嘧啶药物残留的方法，用液-液萃取的经典方法结合固相萃取，建立了合适的样品提取、净化、浓缩的前处理方法，并优化了高效液相色谱条件，可同时测定鸡肉中上述7种磺胺类药物残留，该法简便、准确，可用于该类兽药的残留监控。

[1] 特奈普西得.动物源性食品中药物残留分析方法[M]. 于竞，王进喜，等译. 天津：科技翻译出版公司，1991.

[2] 中华人民共和国农业部. 动物性食品中兽药最高残留限量[S/OL]. 2002：21[2016-07-01]. http://www.moa.gov. cn/zwllm/tzgg/gg/200302/t20030226_59300.htm.

[3] 中华人民共和国农业部. 关于发布《兽药残留检测试验技术规范（试行）》的通知[S/OL]. 2003：2-4[2016-07- 01]. http://www.moa.gov. cn/sjzz/syj/dongtai/201006/t20100 606_1535497.htm.

[4] 李俊锁，邱月明，王超. 兽药残留分析[M]. 上海：上海科学技术出版社，2002.

[5] 赵旭壮，李明元. 动物性食品中磺胺类药物残留检测研究进展[J]. 中国食品卫生杂志，2012，24（3）：92-96.

[6] 王小柱. 鸡肉组织中磺胺氯达嗓钠的高效液相色谱法检测[J]. 现代畜牧兽医，2016（2）：10-14.

[7] 张筱艳，方素栋，魏晋梅. 牛肉中磺胺类药物残留的检测分析[J]. 中国草食动物科学，2016，36（3）：34-37.

责任编辑：张爱婷

Determination of Sulfonamides Residue in Chicken by High Performance Liquid Chromatography

ZHANG Ning

（Tianjin Veterinary Drugs and Feed Control Ministry, Tianjin 300402, China）

High performance liquid chromatography（HPLC）method was developed for the determination of sulfonamides residue in chicken, the chicken samples extracted with acetonitrile after homogenization, extracts were purified by Sep-Pak alumina column, determined by HPLC and ultraviolet UV detector, with acetonitrile methanol-water-acetic acid（2∶2∶9∶0.2, v/v）as mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was 270 nm.The results showed that the peak area and concentration of the drug in the range of 0.1 to 5.0 mu g/mL, the correlation coefficient was greater than 0.999 6, the detection limit was 0.05 μg/kg, and the limit of quantification was 0.5 μg/kg. Among the 0.05, 0.20 and 0.50 μg/kg concentrations, the recovery was in the range of 60%～100%（=7）, and the relative standard deviation of the relative standard deviation was less than 15%. Compared with the traditional method, this method has a great improvement in detection speed and quantity.

chicken; Sep-Pak alumina column; high performance liquid chromatography; sulfonamides; residue

1008-5394（2017）01-0034-04

P641.131；S152.72

A

2016-07-01

张宁（1959-），男，吉林长春人，高级兽医师，本科，主要从事兽药残留方面的研究。E-mail：zhangning_1959@163.com。