秦国华,王瑞霞,徐志芳,3,桑 楠



核呼吸因子1在心肌细胞损伤中的保护作用

秦国华1,2*,王瑞霞1,徐志芳1,3,桑 楠1

(1.山西大学环境与资源学院,山西太原 030006；2.暨南大学环境学院,广州市环境暴露与健康重点实验室,广东广州510632；3.山西省环境规划院,山西太原 030001)

构建含有核呼吸因子1(NRF1)cDNA全长的质粒NRF1-pcDNA3.1,用该质粒转染H9C2细胞,探讨NRF1在NaHSO3诱导心肌细胞线粒体损伤中的作用.用空质粒或NRF1-pcDNA3.1转染H9C2细胞,100mmol/L的NaHSO3处理转染后的H9C2心肌细胞24h后,首先采用Western blot免疫印迹法检测H9C2心肌细胞中NRF1和线粒体转录因子A(TFAM)蛋白的表达情况.其次,采用化学发光法检测细胞中ATP含量,考察NRF1对NaHSO3诱导H9C2心肌细胞线粒体损伤的影响.结果表明,与未染毒组相比,空质粒转染组NaHSO3染毒24h后, NRF1和TFAM蛋白的表达及ATP含量均降低;而NRF1-pcDNA3.1转染显著上调了NRF1和TFAM蛋白表达和细胞内ATP含量; NRF1-pcDNA3.1转染的H9C2细胞经过NaHSO3染毒24h后,与空质粒转染后NaHSO3染毒组相比, NRF1和TFAM的蛋白表达及ATP含量均极显著上升.由此说明: NaHSO3可降低H9C2细胞中NRF1和TFAM表达及ATP含量, NRF1的高表达可通过调控下游基因TFAM的表达进而增加细胞内ATP的产生,并且NRF1的高表达可使暴露于NaHSO3所引起的线粒体功能异常得到缓解,揭示NRF1在调节NaHSO3诱导的线粒体损伤过程中有重要意义.

NRF1；TFAM；亚硫酸氢钠；质粒构建

随着工业化和城市化的快速发展,近几十年亚洲地区的空气污染逐渐加重,而SO2是主要污染物之一.SO2主要是由含硫物质燃烧产生的,通过呼吸系统进入体内后,会与水结合生成亚硫酸盐(SO32-)和亚硫酸氢盐(HSO3-),两者在中性溶液中以摩尔比为3:1的动态平衡状态下存在[1].SO2及其衍生物进入机体后,会增加心血管疾病,如心梗、心律失常、缺血性心脏病、心力衰竭等的发生率和死亡率[2].此外,作为一种食品添加剂,亚硫酸氢盐广泛用于水果、蔬菜的保鲜.实验室前期研究表明, SO2进入机体后可到达小鼠各个组织器官(包括心脏),造成氧化应激和DNA损伤[3-4].进一步研究显示, SO2可以引起小鼠心脏超微结构的改变,其中以线粒体最明显,受损伤最严重[5].

前期研究发现, SO2的衍生物NaHSO3可诱导大鼠心肌细胞线粒体结构及功能的损伤,表现为线粒体膜电位、细胞色素C氧化酶活性及ATP含量降低.与此同时,线粒体DNA(mtDNA)含量减少,调控mtDNA的核呼吸因子1(NRF1)和线粒体转录因子A(TFAM)的表达也降低.通过构建TFAM-pcDNA3.1质粒,发现在H9C2细胞中高表达TFAM后, TFAM的蛋白表达显著上升, ATP含量也显著上升[6].为了进一步探究NRF1是否是SO2及其衍生物诱导线粒体功能紊乱的决定因素,本研究中我们构建了NRF1-pcDNA3.1重组质粒,并将其在H9C2细胞中高表达,研究NRF1在SO2诱导心肌细胞线粒体损伤信号通路中的作用,为SO2长期接触所诱导的心血管疾病的预防及治疗提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 质粒、细胞和培养基

研究中采用的pcDNA3.1质粒为山西大学马恩波老师实验室赠送. H9C2细胞来自国家实验细胞资源共享平台.大鼠心肌细胞H9C2来源于胚胎期BD1X大鼠心脏组织的亚克隆细胞系,表现很多骨骼肌细胞的特性.H9C2细胞在含10%胎牛血清(FBS, Invitrogen)的DMEM培养基中进行培养.

1.2 实验材料

Trizol、LA Taq酶购自Takara公司;反转录试剂盒购自Fermentas;ATP检测试剂盒均购自Beyotime公司;限制性内切酶购自NEB公司;连接酶、pGEM-T easy Vector、FuGENE HD转染试剂盒购自Promega公司;其他试剂均为分析纯.

1.3 NRF1-pcDNA3.1的质粒构建

1.3.1 NRF1基因的获取 取100mg左右Wistar大鼠心脏组织,加入1mL Trizol匀浆,提取总RNA.蛋白核酸测定仪测RNA的浓度及OD260/OD280,确保比值在1.9~2.1的范围内.取1µg总RNA,采用反转录试剂盒合成cDNA,加入NRF1上下游引物,上游引物为5′-GTCGAATGA TCTGTGGTTCA-3′,下游引物为5′-GCCGTTTA TTTCCTTTTCAGTTGC-3′,使用Analytik Jena荧光定量PCR仪进行扩增.反应体系为100µL,其中buffer 10µL、MgCl210µL、dNTP 16µL、Taq酶0.5µL、上下游引物各4µL、cDNA 4µL.扩增程序为:95℃预变性4min;95℃30s,55℃ 30s,72℃ 2min进行35个循环;72℃延伸10min, 4℃终止.琼脂糖凝胶电泳检测目的DNA片段大小.然后以此PCR的产物为模板,加入含H I和I双酶切位点的引物,上游引物为5′-GCAG- GATCCCGAATGATCTGTG-3′,下游引物为5′- ACTCTCGAGCCGTTTATTTCC-3′进行扩增,反应体系与反应条件同上.琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物,并用胶回收试剂盒回收DNA片段.

1.3.2 含NRF1基因片段重组质粒的构建 胶回收DNA产物与pcDNA3.1质粒经H I和I双酶切后,酶切产物在T4DNA连接酶的催化下,混合4℃过夜连接.然后转化、挑取单克隆菌落,进行摇菌扩增并提取质粒.通过菌落PCR及质粒酶切初步鉴定重组质粒,选取酶切鉴定成功的质粒送往英骏公司进行序列测定.

1.4 细胞培养及染毒

H9C2细胞,用加入10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃,5% CO2培养箱中进行培养.细胞生长到50%~60%时,用0.4μg空质粒pcDNA3.1或NRF1-pcDNA3.1和1µL FuGENE HD转染试剂转染24h之后再加100μmol/L NaHSO3染毒24h,每组设3个平行样.细胞存活率采用MTT法检测.

1.5 Western blot

取1´106H9C2细胞,加入蛋白裂解液进行匀浆,12000´,4℃条件下离心15min,提取蛋白,取30μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳,转到NC膜上,封闭,加入目的蛋白抗体(anti-GAPDH一抗, CST; anti-NRF1一抗, Anbo; anti-TFAM一抗, BioVision)4℃孵育过夜,荧光标记二抗(IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG(H+L), LI-COR)孵育后, LI-COR Odyssey双色红外激光成像系统进行扫描检测.每组设3个平行样,每样测定2次.

1.6 胞内ATP的检测

将生长至70%~80%状态良好的细胞用200µL ATP检测裂解液进行裂解,4℃,12000×,离心10min,取上清,使用酶标仪检测相对光单位值(RLU),考马斯亮蓝法测定蛋白含量.用试剂盒中ATP标准品设立ATP浓度梯度,测定RLU值,建立RLU值-ATP浓度的标准曲线,所测得RLU值/对应的ATP上清蛋白含量,即为所求结果,每组设3个平行样,每样测定3次.

1.7 数据统计分析

用SPSS 11.5统计软件对实验数据进行分析,采用单因素方差分析与LSD多重比较,0.05时认为具有统计学显著性.

2 结果

2.1 菌落PCR的扩增含酶切位点NRF1结果

如图1所示,菌落PCR扩增显示在1500~ 2000bp有特异性产物,与预期目的片段(1795bp)大小吻合,初步证明所选菌落中含NRF1- pcDNA3.1.

2.2 重组质粒NRF1-pcDNA3.1的酶切结果

如图2所示,将双酶切后的重组质粒NRF1- pcDNA3.1进行电泳,可观察到有2条带, Lane2的上方条带为pcDNA3.1质粒,下方为NRF1条带.进一步表示NRF1-pcDNA3.1质粒构建成功.

2.3质粒转染及NaHSO3处理对细胞存活率影响

如图3所示,转染空质粒或重组质粒NRF1- pcDNA3.1对细胞存活率影响无显著差异, 100μmol/L NaHSO3处理对细胞存活率也无明显影响.细胞存活率均在90%以上.

2.4 NRF1过表达对线粒体相关蛋白表达的影响

如图4所示,转染空质粒后,再用100μM NaHSO3处理H9C2细胞24h, NRF1和TFAM的蛋白含量与空质粒转染组相比均显著降低(0.05).重组质粒NRF1-pcDNA3.1转染组与空质粒转染组相比,细胞中NRF1蛋白极显著增高,表示NRF1高表达成功,同时其下游蛋白—TFAM的蛋白含量也显著升高(0.01).与空质粒转染组相比,细胞转染NRF1-pcDNA3.1后再暴露于NaHSO3,NRF1和TFAM的蛋白含量均显著增高,表明NRF1高表达可有效恢复NaHSO3所致的NRF1和TFAM的表达降低.

2.5 NRF1过表达对胞内ATP含量的影响

如图5所示,转染空质粒后,再用100μmol/L NaHSO3处理H9C2细胞24h,胞内ATP含量与空质粒转染组相比显著降低(0.05).重组质粒NRF1- pcDNA3.1转染组与空质粒转染组相比,胞内ATP含量极显著增高,表示NRF1高表达可导致胞内ATP含量上升.与空质粒转染组相比,细胞转染NRF1-pcDNA3.1后再暴露于NaHSO3胞内ATP含量显著增高,表明NRF1高表达可有效恢复NaHSO3所致的胞内ATP含量降低.

3 讨论

线粒体是细胞进行氧化磷酸化的主要场所,是提供细胞能量的主要来源,而心脏是高度依赖ATP的器官.所以,研究污染物对心肌细胞线粒体的损伤很有必要.线粒体生物合成受转录因子,如核呼吸因子(NRFs)和TFAM等调节[7-9].其中, NRF1基因能调节由核编码的线粒体呼吸链部分亚基的表达[10]. TFAM是一个核编码的HMG蛋白,通过序列结合重链启动子(HSP)和轻链启动子来刺激mtDNA的转录[11-13]. TFAM具有调节mtDNA的拷贝数,维护mtDNA的完整和稳定,以及促进mtDNA损伤修复的功能,若无转录因子存在,mtRNA聚合酶则不能识别线粒体转录启动子,而仅有极弱的非特异性转录活性[14].相关研究表明:NRF1可以激活mtDNA的转录因子TFAM,进而影响线粒体编码的氧化磷酸化复合物的表达,包括F0F1的α与β亚基、细胞色素C氧化酶的亚基和UCPs等[15-16].敲除NRF1基因的小鼠表现出mtDNA数量的显著减少,这种现象在胚胎发育过程中是致命的[17].由此可得, NRF1和TFAM基因是mtDNA复制和表达必不可少的因子[18].

亚硫酸氢盐和亚硫酸盐等试剂已被广泛用于抗氧化等食品加工领域,在正常的人体血清中,亚硫酸盐的平均浓度为5μmol/L,然而口服富含亚硫酸盐的蔬菜汁30min后,血浆中亚硫酸盐的浓度上升为112μmol/L[19].相关研究表明,浓度低于100μmol/L的NaHSO3对细胞活力无显著差异. NaHSO3浓度为300μmol/L时,细胞活力出现显著下降[6].因此,使用100μmol/L的NaHSO3进行体外实验,具有一定实际意义.本研究中, 100μmol/L NaHSO3可引起H9C2细胞中NRF1、TFAM蛋白表达和ATP含量的显著降低,这与先前关于SO2对大鼠心肌细胞的研究结果相一致.实验表明,高表达NRF1也引起TFAM的高表达,使得ATP的产量显著增加.心肌细胞在急、慢性缺氧及多种病理状态下ATP含量均会降低[20],而高表达NRF1的H9C2细胞暴露于相同浓度的NaHSO3之后, NRF1和TFAM的蛋白表达以及ATP的产量均发生显著上调.心肌细胞内ATP含量的恢复可有效提高心肌供氧,减少由于线粒体产能不足引起的其他损伤,如维持线粒体钙稳态、保护线粒体内膜功能等.我们前期的研究表明, SO2动式染毒暴露Wistar大鼠,可能通过降低NRF1的表达,影响了其对TFAM的调控,进一步抑制了线粒体基因组转录,使心肌线粒体的氧化磷酸化功能受损[21].在对高脂饮食的研究中证实, C57BL/6J小鼠暴露于酮症诱发性和非诱导性的高脂饮食,都引起了NRF1和TFAM mRNA水平的显著下降,从而降低了mtDNA的复制和转录[22].同时, NRFs(包括NRF1)会诱导氧化磷酸化(OXPHOS)基因的转录,使细胞核编码的蛋白转移至线粒体上[23],而促进线粒体的合成. TFAM是核编码转录因子,需要从胞浆转入线粒体才能发挥活性.而在整个运转过程中,前体蛋白TFAM的前导肽序列、胞浆中分子伴侣Chsp70、外膜表面受体Tom20、外膜转位酶复合体核心分子Tom40、内膜转位酶复合体Tim23、基质中mtHSP60和线粒体的膜电位都发挥了重要的作用[24].由此,我们推测通过高表达的NRF1调控下游基因TFAM,使得线粒体生物合成增加,减缓了NaHSO3的暴露对线粒体的损伤,使线粒体功能得到改善.这对探讨NRF1在SO2及其衍生物诱导线粒体损伤和凋亡途径的通路具有重要的意义.

本实验证实了NRF1在NaHSO3-NRF1- TFAM-mtDNA-ATP信号通路中的重要作用.此外,在线粒体损伤过程中,过氧化物酶体增生物激活受体γ辅激活因子-1α (PGC-1α)[25]、AMPK[23]及炎性细胞因子均可能参与,SO2及其衍生物诱导线粒体损伤是否有上述因子的参与有待进一步研究,对探究保护和维持线粒体功能的机制有重要意义.

4 结论

4.1 100μmol/L的NaHSO3处理空质粒转染后的H9C2细胞,下调了NRF1和TFAM蛋白的表达,同时导致胞内ATP含量降低.

4.2 通过构建重组质粒NRF1-pcDNA3.1并转染H9C2细胞,使NRF1高表达,并且上调了TFAM的表达和ATP含量的产生.

4.3 NRF1的高表达可能通过NRF1-TFAM- mtDNA的信号通路使NaHSO3的暴露引起线粒体功能异常得到缓解, NRF1对SO2及衍生物诱导的线粒体功能紊乱具有保护作用.

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The protect role of nuclear respiratory factor 1 in mitochondrial damage in cardiac muscles.

QIN Guo-hua1,2*, WANG Rui-xia1, XU Zhi-fang1,3, SANG Nan1

(1.College of Environmental Science and Resources, Shanxi University, Taiyuan 030006, China；2.Guangzhou Key Laboratory of Environmental Exposure and Health, School of Environment, Jinan University, Guangzhou 510632, China；3.Shanxi Academy for Environmental Planning, Taiyuan 030001, China).

We constructed a NRF1-pcDNA3.1 plasmid and transfected it in H9C2 cells to explore the effects of NRF1 in sodium bisulfite-induced mitochondrial damage in cardiac muscles of rats. H9C2 cells were treated with 100mmol/L NaHSO3for 24h after NRF1-pcDNA3.1 or pcDNA3.1 transfection. Protein levels of NRF1 and TFAM were measured by Western blotting. The amount of ATP was detected by the chemiluminescence method. It showed that NaHSO3treatment for 24h resulted in significant decreases of NRF1 and TFAM protein expression and ATP amount. The protein levels of NRF1 and TFAM were significantly elevated after NRF1-pcDNA3.1 plasmid transfection, companied by a significant increase of ATP amounts. NRF1and TFAM protein expressions and ATP amount significantly increased after NaHSO3exposure for 24h in NRF1 over-expression group, compared with the pcDNA3.1-transfection group. It implied that over-expression of NRF1 might regulate TFAM to increase intracellular ATP production. In addition, over-expression of NRF1 alleviated the dysfunction of mitochondrial ATP caused by NaHSO3exposure. NRF1 plays an important role in the regulation of NaHSO3-induced mitochondrial damage.

NRF1；TFAM；NaHSO3；over-expression plasmid

X503

A

1000-6923(2017)04-1556-06

2016-07-21

国家自然科学基金资助项目(21007036);广州市环境暴露与健康重点实验室开放基金资助项目(GZKLEEH201612);环境化学与生态毒理学国家重点实验室开放基金资助项目(KF2016-17)

秦国华(1977-),女,山西潞城人,教授,博士,主要从事环境与健康方面的研究.发表论文40余篇.

* 责任作者, 教授, qinguojua@sxu.edu.cn

, 2017,37(4)：1556~1561