马 静,郑照明,王朝朝,杜 佳,李 军*



抗生素对厌氧氨氧化颗粒污泥脱氮性能的影响

马 静1,郑照明1,王朝朝2,杜 佳1,李 军1*

(1.北京工业大学,北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室,北京 100124；2.河北工程大学城市建设学院,河北邯郸056038)

通过血清瓶批试实验,研究了3种具有不同抑制机理的抗生素(青霉素G钠、土霉素盐酸盐和硫酸多粘菌素E)对厌氧氨氧化颗粒污泥脱氮性能的短期抑制特性.不添加抗生素时,厌氧氨氧化颗粒污泥的NH4+-N和NO2--N降解速率分别为0.252,0.375kg N/(kg VSS·d).浓度为3000mg/L的青霉素G钠对厌氧氨氧化颗粒污泥的活性抑制作用较小.土霉素盐酸盐和硫酸多粘菌素E对厌氧氨氧化颗粒污泥的活性抑制作用较强.土霉素盐酸盐浓度分别为50,100,150,200,400mg/L实验组的NH4+-N降解速率分别为0.250,0.237,0.200,0.117,0.062kg N/(kg VSS·d); NO2--N降解速率分别为0.324,0.304,0.296,0.244,0.069kg N/(kg VSS·d).硫酸多粘菌素E浓度分别为30,70,90,100,300mg/L实验组的NH4+-N降解速率分别为0.230,0.134,0.094,0.022,0.007kg N/(kg VSS·d); NO2--N降解速率分别为0.351,0.203,0.133,0.039,0.004kg N/(kg VSS·d).青霉素G钠、土霉素盐酸盐和硫酸多粘菌素E对厌氧氨氧化颗粒污泥活性的抑制作用依次增强.

厌氧氨氧化；颗粒污泥；抗生素；批试实验；抑制作用

抗生素类生物制药废水和畜禽养殖业废水中含有较高浓度的有机物、氨氮和抗生素[1-2].目前国内应用的抗生素废水处理技术基本以生物法为主,并辅助以物理、化学方法.不同种类抗生素对微生物的抑制机理不同,其中青霉素、先锋霉素、环丝氨酸和万古霉素等可干扰细胞壁的合成;四环素、庆大霉素、氯霉素和链霉素等可干扰核糖体的蛋白质合成;多粘菌素可破坏细胞质膜的结构[3-4].厌氧氨氧化作为一种新型的生物脱氮工艺,有助于减少脱氮过程中碳源的投加和能源的浪费[5].但是厌氧氨氧化菌生长速度慢、细胞产率低、倍增时间长达(11d),对环境条件要求极为苛刻[6].批试装置和连续流反应器研究抗生素对厌氧氨氧化菌活性的短期和长期抑制特性表明,青霉素G对厌氧氨氧化菌活性的短期抑制作用较小,对厌氧氨氧化菌活性的长期抑制作用强烈[7].土霉素对厌氧氨氧化活性的短期与长期抑制特性和青霉素类似[8-9].到目前为止,不同种类抗生素对厌氧氨氧化菌活性抑制特性的系统性研究较少.此外,厌氧氨氧化颗粒污泥中厌氧氨氧化菌密度和胞外聚合物含量较高,对不利环境具有较好的耐受能力,在工程中的应用较多,有必要就不同种类抗生素对厌氧氨氧化颗粒污泥活性的抑制特性进行研究[10].

本研究通过批试实验同时考察不同抑制特性的抗生素(青霉素、土霉素和硫酸多粘菌素)对厌氧氨氧化颗粒污泥活性的短期抑制特性,以期了解不同抑制特性的抗生素对厌氧氨氧化颗粒污泥的抑制毒性,为厌氧氨氧化工艺处理抗生素废水提供技术支持.

1 材料与方法

1.1 厌氧氨氧化颗粒污泥来源

厌氧氨氧化颗粒污泥取自实验室已稳定运行的UASB-生物膜反应器底部.有效容积为10L,采用黑色软性材料包裹以避光,反应器上方2/3部分添加直径为10cm的聚氯乙烯球形填料以减少污泥的流失.进水NH4+-N浓度为40~50mg/L, NO2--N浓度为50~60mg/L,其余组分和微量元素控制参照文献[11].反应器温度控制为28~30℃,进水由浓水和未经消氧的自来水组成,溶解氧为3~4mg/L, HRT为1.5h, TN平均去除率为78.87%, TN平均容积去除负荷为1.5kg/(m3·d).污泥经测序,主要厌氧氨氧化菌种类为Candidatus Brocadia fulgida (JX852965-JX8 52969).厌氧氨氧化颗粒污泥取出后,先用自来水冲洗3遍以去除表面的残留基质,颗粒污泥呈砖红色,粒径为2~3mm.

1.2 批试实验

1.2.1 批试实验水质 批试实验采用人工配水,主要氮素成分为NH4Cl和NaNO2.初始NH4+-N和NO2--N浓度分别为70,80mg/L.实验所用的抗生素种类分别为青霉素G钠、土霉素盐酸盐和硫酸多粘菌素E(购自合肥博美生物科技有限责任公司),均达到USP级,浓度按需添加.

1.2.2 批试实验装置与步骤 批试实验采用500mL血清瓶(图1),污泥浓度的确定:用分析天平称取14g左右湿污泥,将污泥和模拟配水一起放入血清瓶中.同时取5g左右湿污泥用滤纸包好,经烘箱和马弗炉处理,烘干时间及温度同常规污泥浓度测量条件相同,得到干物质/湿泥、挥发性物质/湿泥的比值,反算血清瓶中的MLSS和MLVSS.

厌氧氨氧化活性的测定参照文献[12-13],为了保证厌氧氨氧化颗粒污泥的活性,进行如下操作: (1)配置泥水混合液; (2)启动恒温磁力搅拌器,转速为200r/min,盖紧瓶塞,通氮气30min(氮气纯度99.999%); (3)停止通氮气,将血清瓶连同磁力搅拌器放入30℃的恒温培养箱中.每隔一定时间取样测定NH4+-N、NO2--N和NO3--N浓度,每次取样体积5mL.

1.3 分析方法

NH4+-N:纳氏试剂光度法;NO2--N:N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法;NO3--N:麝香草酚分光光度法;MLSS、MLVSS:重量法;DO、温度: WTW/Multi 3420测定仪.

2 结果与讨论

2.1 不添加抗生素实验组厌氧氨氧化颗粒污泥的脱氮活性

由图2可见,颗粒污泥表现出良好的厌氧氨氧化活性.初始NH4+-N和NO2--N浓度都为70mg/L左右,随着反应的进行, NH4+-N和NO2--N浓度逐渐降低, NO3--N浓度逐渐上升. △NO2--N/△NH4+-N(摩尔比)=1.47, △NO3--N/ △NH4+-N(摩尔比)=0.34,和Strous等[6]的研究结果相近.厌氧氨氧化批试NH4+-N和NO2--N降解速率分别为0.252,0.375kg N/(kg VSS·d).

2.2 青霉素G钠对厌氧氨氧化颗粒污泥脱氮活性的影响

由图3可见,当青霉素G钠浓度高于400mg/ L时,采用纳氏试剂光度法测得的NH4+-N浓度高于批试实验所配置的NH4+-N浓度,推测青霉素G钠与纳氏试剂反应,对NH4+-N的测定造成干扰,故不再讨论NH4+-N的降解过程.但是批试过程中NO2--N的降解以及NO3--N的生成过程均表现出良好的线性关系,对底物转化过程进行线性拟合.不同青霉素G钠浓度作用下厌氧氨氧化颗粒污泥的脱氮活性如表1所示.青霉素G钠浓度分别为100,400,1000,2000,3000mg/L实验组NO2--N的降解速率相差不大,分别为0.346,0.382, 0.405,0.387,0.402kg N/(kg VSS·d) (图3a); NO3-- N的生成速率分别为0.100,0.094,0.088,0.076, 0.070kg N/(kg VSS·d) (图3b).从NO2--N的降解速率和NO3--N的生成速率可以看出,青霉素G钠浓度对对颗粒污泥厌氧氨氧化活性的影响较小.

Van de Graaf等[14]的批试研究表明,浓度为0~100mg/L的青霉素对污泥的厌氧氨氧化活性抑制作用较小.Jetten等[15]的批试研究表明,当青霉素G浓度小于1000mg/L时,厌氧氨氧化菌的活性没有受到影响.Hu等[7]通过批试装置和连续流反应器系统地研究了青霉素G钾对厌氧氨氧化絮体污泥活性的短期和长期抑制特性.他们采用絮体污泥进行研究的原因是厌氧氨氧化颗粒污泥中可能存在青霉素降解菌,而且颗粒污泥表面的蛋白质对青霉素的传质可能具有阻碍作用.结果表明在批试装置中,浓度为0~2000mg/L的青霉素G钾对厌氧氨氧化菌的活性影响较小;在连续流反应器中,浓度为500~5000mg/L的青霉素G钾对厌氧氨氧化菌的活性具有强烈抑制作用.本研究的批试实验表明,青霉素G钠对厌氧氨氧化颗粒污泥的活性影响较小,和前人的研究报道一致[7,15].青霉素是-内酰胺类窄谱抗生素,主要抑制革兰氏阳性菌,作用机制为抑制转肽酶和细胞壁上肽聚糖的合成[16].厌氧氨氧化菌属于浮霉菌门,细胞壁不含肽聚糖,所以批试实验中青霉素G钠对厌氧氨氧化活性的影响较小[17].但是, Hu等[7]的研究表明,青霉素G钾对厌氧氨氧化菌的生长和蛋白质合成具有一定的抑制作用,由于厌氧氨氧化菌的生长速率较慢,倍增时间长度11d,所以批试实验中青霉素G钾对厌氧氨氧化菌的活性没有明显抑制作用;而在连续流实验中,污泥的厌氧氨氧化活性受到抑制.最近关于厌氧氨氧化菌宏基因组的资料显示,厌氧氨氧化菌的基因组中存在编码肽聚糖合成以及肽聚糖结合蛋白的基因[18].因此,在长期运行中,青霉素G可能通过抑制肽聚糖的合成从而抑制厌氧氨氧化菌的活性.青霉素G钠对厌氧氨氧化颗粒污泥活性的长期抑制特性有待于进一步研究.

表1 不同浓度青霉素G钠条件下的厌氧氨氧化活性

2.3 土霉素盐酸盐对厌氧氨氧化颗粒污泥脱氮活性的影响

由图4可见,批试过程中NH4+-N和NO2--N的降解以及NO3--N的生成过程均表现出良好的线性关系,对底物转化过程进行线性拟合.不同土霉素盐酸盐浓度作用下厌氧氨氧化颗粒污泥的脱氮活性如表2所示.土霉素盐酸盐浓度分别为50,100,150,200,400mg/L实验组的NH4+-N降解速率分别为0.250,0.237,0.200,0.117,0.062kg N/(kg VSS·d) (图4a); NO2--N的降解速率分别为0.324,0.304,0.296,0.244,0.069kg N/(kg VSS·d) (图4b); NO3--N的生成速率分别为0.076,0.061, 0.057,0.035,0.011kg N/(kg VSS·d) (图4c).从NH4+-N和NO2--N的降解速率可以看出,低浓度土霉素对颗粒污泥的厌氧氨氧化活性抑制作用较小;高浓度土霉素对颗粒污泥的厌氧氨氧化活性抑制作用强烈.和未添加抗生素实验组相比,土霉素盐酸盐浓度分别为50,100,150,200,400mg/L实验组的厌氧氨氧化亚硝态氮降解速率分别下降了13.6%、18.8%、21.1%、35.0%和81.7%.

表2 不同浓度土霉素盐酸盐条件下的厌氧氨氧化活性

和土霉素对厌氧氨氧化污泥的长期抑制特性相比,厌氧氨氧化污泥对土霉素短期抑制的耐受能力较强. Noophan等[19]的研究表明,在批试装置中,浓度为10~100mg/L的土霉素对厌氧氨氧化污泥的活性具有强烈的抑制作用.在连续流反应器中,控制土霉素浓度为5mg/L,经过5周时间,污泥的厌氧氨氧化活性被完全抑制. Yang等[8]的研究表明,厌氧氨氧化颗粒污泥对土霉素具有良好的耐受能力.在批试实验中,土霉素对厌氧氨氧化颗粒污泥活性的半抑制浓度(IC50)为517.5mg/L;在连续流实验中,厌氧氨氧化颗粒污泥对土霉素的耐受能力降低,当进水中的土霉素浓度为50mg/L时,经过26d,反应器的总氮去除容积负荷从12.0降低到2kg N/(m3·d),厌氧氨氧化颗粒污泥的活性从16.3降低到1.6mg TN/(g VSS·h). Lotti等[9]的批试研究表明土霉素对厌氧氨氧化颗粒污泥活性的半抑制浓度(IC50)为1100mg/L;在长期抑制实验中,控制土霉素浓度为100mg/L,经过14d,厌氧氨氧化颗粒污泥的活性下降至初始活性的75%.土霉素属于四环类抗生素,研究表明四环素的主要作用机制是特异性地与核糖体30S亚基的A位置结合,阻止氨酰基-tRNA进入A位,破坏核聚糖体形成,从而抑制细菌的生长[9].本研究的厌氧氨氧化颗粒污泥粒径约为2~3mm,对土霉素盐酸盐的耐受能力和Yang等[8]的研究结果相近.厌氧氨氧化颗粒污泥对土霉素的抑制作用具有较强的耐受能力,其可能的原因分析如下:首先,颗粒污泥粒径对底物的传质具有阻碍作用,有助于缓解土霉素对厌氧氨氧化菌的抑制作用[20].其次,Tang等[21]的研究表明,厌氧氨氧化颗粒污泥表面具有大量的胞外聚合物,电负性较强,可以对溶液中的有毒物质进行吸附,从而缓解有毒物质对厌氧氨氧化菌的抑制作用.此外, Tan等[22]的研究表明,在高度聚集的条件下,微生物的基因表达能力更强,对不利环境的适应能力更强.颗粒污泥中厌氧氨氧化菌的聚集密度较高,可能有助于缓解土霉素对厌氧氨氧化菌的抑制作用.

2.4 硫酸多粘菌素E对厌氧氨氧化颗粒污泥脱氮活性的影响

由图5可见,NH4+-N和NO2--N的降解以及NO3--N的生成过程均表现出良好的线性关系,对底物转化线性阶段进行直线拟合.不同硫酸多粘菌素E浓度作用下厌氧氨氧化颗粒污泥的脱氮活性如表3所示.硫酸多粘菌素E浓度分别为30,70,90,100,300mg/L实验组的NH4+-N降解速率分别为0.230,0.134,0.094,0.022,0.007kg N/(kg VSS·d) (图5a); NO2--N的降解速率分别为0.351, 0.203,0.133,0.039,0.004kg N/(kg VSS·d) (图5b); NO3--N的生成速率分别为0.062,0.043,0.025, 0.022,0.010kg N/(kg VSS·d) (图5c).和未添加抗生素实验组相比,硫酸多粘菌素E浓度分别为30,70,90,100,300mg/L实验组的厌氧氨氧化亚硝态氮降解速率分别下降了6.2%、45.7%、64.4%、89.6%和98.9%.

Ding等[23]的批试研究结果表明,硫酸多粘菌素B对污泥厌氧氨氧化活性的半抑制浓度(IC50)为10.2mg/L.多粘菌素是从多粘杆菌培养液中获得的多肽类抗生素,对多数革兰氏阴性杆菌有杀灭作用.多粘菌素含有带正电荷的游离氨基,能与革兰氏阴性菌细胞膜的磷脂中带负电荷的磷酸根结合,使细菌细胞膜面积扩大,通透性增加,细胞内的磷酸盐、核苷酸、氨基酸等成分外漏,导致细菌死亡.本研究未添加抗生素实验组批试结束后的溶液无色透明,但是硫酸多粘菌素E为300mg/L实验组批试结束后的溶液呈淡红色,可能的原因是高浓度的硫酸多粘菌素E使厌氧氨氧化菌的细胞膜通透性增加,细胞内的血红素等成分外漏[1,24-25].本研究硫酸多粘菌素E对厌氧氨氧化颗粒污泥的抑制毒性低于Ding等[23]的研究结果.可能的原因是本研究采用厌氧氨氧化颗粒污泥,颗粒污泥粒径对硫酸多粘菌素E的传质阻碍、颗粒污泥表面EPS对硫酸多粘菌素E的吸附和厌氧氨氧化菌的高度聚集状态有助于缓解硫酸多粘菌素E对厌氧氨氧化菌的抑制作用[20-22].

表3 不同浓度硫酸多粘菌素E条件下的厌氧氨氧化活性

3 结论

3.1 在批试实验中,青霉素G钠对厌氧氨氧化颗粒污泥的活性抑制作用较小.青霉素G钠浓度分别为0,100,400,1000,2000,3000mg/L实验组的厌氧氨氧化亚硝态氮的降解速率相差不大,分别为0.375,0.346,0.382,0.405,0.387,0.402kg N/(kg VSS·d).

3.2 在批试实验中,土霉素盐酸盐和硫酸多粘菌素E对厌氧氨氧化颗粒污泥的活性抑制作用较强.和未添加抗生素实验组相比,土霉素盐酸盐浓度分别为50,100,150,200,400mg/L实验组的厌氧氨氧化亚硝态氮降解速率分别下降了13.6%, 18.8%,21.1%,35.0%,81.7%;硫酸多粘菌素E浓度分别为30,70,90,100,300mg/L实验组的厌氧氨氧化亚硝态氮降解速率分别下降了6.2%,45.7%, 64.4%,89.6%,98.9%.

3.3 青霉素G钠、土霉素盐酸盐和硫酸多粘菌素E对厌氧氨氧化颗粒污泥的活性抑制作用依次增强.在批试实验中,厌氧氨氧化颗粒污泥对3种不同抑制特性的抗生素具有较好的耐受能力,这些抗生素对厌氧氨氧化菌活性的长期抑制作用、菌体的自我保护机制以及微生物群落变化规律有待进一步研究.

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Effect of antibiotics on the nitrogen removal performance of anammox granules.

MA Jing1, ZHENG Zhao-ming1, WANG Zhao-zhao2, DU Jia1, LI Jun1*

(1.Beijing Key Laboratory of Water Science and Water Environmental Recovery Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China；2.College of Urban Construction, Hebei University of Engineering, Handan 056038, China).

The inhibition effect of three different kinds of antibiotics on the nitrogen removal performance of anammox granules was investigated by serum bottle batch tests. The antibiotics used in the experiment were penicillin G sodium, oxytetracycline HCl and polymyxin E sulphate, which performed different inhibition mechanisms. As a result, when the batch test was conducted without the addition of antibiotic, the NH4+-N and NO2--N removal rates of the anammox granules were 0.252 and 0.375kg N/(kg VSS·d), respectively. Besides, the anammox activity of the granules was not inhibited with the penicillin G sodium concentration of 3000mg/L. However, the anammox activity of the granules was largely inhibited by oxytetracycline HCl and polymyxin E sulphate. With the oxytetracycline H

oncentrations of 50, 100, 150, 200 and 400mg/L, the NH4+-N removal rates were 0.250, 0.237, 0.200, 0.117 and 0.062kg N/(kg VSS·d), respectively; The NO2--N removal rates were 0.324, 0.304, 0.296, 0.244 and 0.069kg N/(kg VSS·d), respectively. Meanwhile, with the polymyxin E sulphate concentrations of 30, 70, 90, 100 and 300mg/L, the NH4+-N removal rates were 0.230, 0.134, 0.094, 0.022 and 0.007kg N/(kg VSS·d), respectively; The NO2--N removal rates were 0.351, 0.203, 0.133, 0.039 and 0.004kg N/(kg VSS·d), respectively.The inhibition effects of the three kinds of antibiotics were in the order as follows: polymyxin E sulphate>oxytetracycline HCl>penicillin G sodium.

anammox；granules；antibiotics；batch test；inhibition effect

X703.5

A

1000-6923(2017)04-1315-07

2016-08-10

国家水体污染控制与治理科技重大专项(2015ZX 07202-013)

马 静(1992-),女,河北张家口人,北京工业大学硕士研究生,主要从事厌氧氨氧化脱氮研究.

* 责任作者, 教授, jglijun@bjut.edu.cn

, 2017,37(4)：1315~1321