刘颖沙， 李建科， 张 琳， 刘美慧， 宋兵兵

（1.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119；2.杨凌职业技术学院 生物工程分院，陕西 杨凌712100）

柑橘汁中嗜酸耐热菌的分离、鉴定以及单宁酸对其抑菌作用研究

刘颖沙1，2， 李建科*1， 张 琳1， 刘美慧1， 宋兵兵1

（1.陕西师范大学 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119；2.杨凌职业技术学院 生物工程分院，陕西 杨凌712100）

采用酸化的凯氏培养基对柑橘中的嗜酸耐热菌进行分离、培养纯化和鉴定并与标准菌株进行对比，再用不同浓度的单宁酸对柑橘中的嗜酸耐热菌进行抑菌试验，确定最低的抑菌浓度。结果表明，分离得到的两株可疑菌可在25～55℃温度范围以及2.4～6.0的pH值范围，符合嗜酸耐热菌的特点。与标准菌株在菌落形态、显微形态、生理生化特性以及16S rDNA等方面进行比较表明，2株分离菌与标准菌株有明显的相似性。抑菌试验表明，单宁酸对嗜酸耐热菌有一定的抑菌作用，单宁酸的最低抑菌浓度为1.25 mg/mL，分离菌与标准菌表现高度相似性。

嗜酸耐热菌；柑橘；单宁酸；抑菌

酸 土 环 脂 芽 孢 杆 菌 （Alicyclobacillus acidoterrestris），俗称为耐热菌、嗜酸耐热菌、耐热耐酸菌等。嗜酸耐热菌为非致病菌，不产生任何已知的毒素。美国NFPA（国家食品生产者联合会）的专家Walls等作了嗜酸耐热菌的致病性试验，结果表明嗜酸耐热菌及其次生代谢物（愈创木酚、卤酚等）对豚鼠在受试范围内无毒性作用。2000年起，国际贸易中严格要求每10 mL浓缩果汁中其含量小于1个，美国及欧洲大部分国家从2002年起要求在浓缩果汁不得检出酸土环脂芽孢杆菌。目前，国内外针对苹果汁、橙汁、橘汁等温带果蔬汁及混合果蔬汁中酸土环脂芽孢杆菌的研究有较多报道[1-7]。

作者以柑橘汁为材料，在分离嗜酸耐热菌并对其形态、生理生化及16S rDNA区鉴定的基础上，应用单宁酸对嗜酸耐热菌进行控制，为提高橙汁加工安全性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌种和培养基

1.1.1 标准菌 Alicyclobacillus acidoterrestris DSM 3922：购自德国菌种保藏中心。

1.1.2 凯氏培养基 （K氏培养基） 0.2 g吐温80，0.2 g葡萄糖，0.5 g酵母粉，1.0 g蛋白胨，3.0 g琼脂粉，溶于200 mL蒸馏水中，混匀，备用。加入0.5 g苹果酸溶于4 mL蒸馏水调酸。

1.1.3 LB培养基 10 g胰蛋白胨，10 g酵母粉，5gNaCl，15 g琼脂，1 L蒸馏水，混匀，备用。

1.1.4 402培养基 0.2 g（NH4）2SO4，0.25 g CaCl2·2H2O，0.5 g MgSO4，2.0 g酵母粉，5.0 g葡萄糖，5.0 g KH2PO4，溶于1 000 mL蒸馏水中，混匀，备用。用体积分数10%H2SO4调pH值至4.0。

1.2 柑橘汁中嗜酸耐热菌的分离、纯化和筛选

1.2.1 分离及保藏培养基的制备 嗜酸耐热菌的分离及保藏均采用酸化的凯氏培养基。1×105Pa高压灭菌25 min，冷却至50～60℃，混入苹果酸溶液进行酸化处理，备用。

1.2.2 柑橘汁中菌种的分离 参照美国库克实验室的方法对嗜酸耐热菌进行分离[8]。

1.2.3 嗜酸耐热菌的纯化 将分离得到的嗜酸耐热菌菌株在K氏培养基上进行平板划线纯化，45℃恒温条件下培养。按此方法连续划线，直至单个平板上为形态单一的菌落。挑取平板上的单菌落进行纯培养，得到纯菌株[9]。

1.2.4 嗜酸耐热菌的筛选 用嗜酸耐热菌的选择培养基（用于果汁中嗜酸耐热菌的检测）对分离菌进行筛选。

1.3 嗜酸耐热菌菌种鉴定

从嗜酸耐热菌的检测和筛选试验中筛选出的2株可疑嗜酸耐热菌的菌株。

1.3.1 嗜酸耐热菌的耐酸耐热特性鉴定 耐酸特性鉴定试验：将纯培养的嗜酸耐热菌菌株划线接种于LB平板培养基 （pH 7.0），45℃恒温培养箱中培养48 h，保留不能在LB平板生长的菌[10]。

耐热特性鉴定试验：将镜检为纯培养的嗜酸耐热菌菌株制成菌悬液，进行热休克处理，再采用涂布法接种于K氏平板培养基上45℃培养24 h，保留可以生长的菌落[11]。

1.3.2 菌落形态 将标准酸土环脂芽孢杆菌和分离得到的2株分离菌，分别划线接种至K培养基平板上，每株菌3个重复，倒置平板，于45℃培养2～4d，观察出现的单菌落的形态特征。

1.3.3 显微形态 将标准酸土环脂芽孢杆菌和分离得到的2株分离菌分别进行革兰氏染色，然后显微镜下观察其细胞形态[12]。

1.3.4 生理生化特征 根据《伯杰细菌鉴定手册》[13]和《常见细菌系统鉴定手册》[14]等工具书将标准菌株和各分离菌分别进行接触酶试验、氧化酶试验、V-P试验、明胶液化试验和淀粉水解试验等生理生化试验。为了保证耐热菌生长所需要的酸性条件，一般采用苹果酸酸化的培养基进行以上生理生化试验。

1.3.5 分子生物学鉴定 采用DNA测序法来对耐热菌进行鉴定，其具体操作如下

1）基因组DNA提取 取2 mL菌液至EP管中，8 000 r/min 2 min，去上清；加140 μL LTE混匀，加60 μL溶菌酶（10 mg/mL），37℃孵育10 min；加400 μL Digestion buffer，混匀后，加3 μL蛋白酶k混匀，55℃孵育5 min；加260 μL乙醇混匀，全部转入UNIQ-10柱中，10 000 r/min 1 min，弃收集管中的废液；加500 μL Wash Solution，10 000 r/min 30 s，重复1次；10 000 r/min 2 min甩干柱中液体。将UNIQ-10柱转移至新的EP管中；加60℃预热的洗脱液50 μL，室温放置3 min。12 000 r/min 2 min，EP管中的液体即为DNA溶液；电泳：上样3 μL。

2）PCR扩增 扩增使用引物：选用细菌16S rDNA 通用引物 27F与 1492R， 序列位于Escherichia coli的16S rDNA基因序列两端保守区域[15]。

委托北京爱普拜生物技术有限公司合成，并进行PAGE纯化。

PCR反应体系见表1。

表1 PCR反应体系Table 1 PCR reaction system

PCR扩增条件：94℃ 3 min预变性；94℃ 30 s，50℃45 s，72℃100 s，35循环；72℃延伸7 min；4℃保存。

3）DNA序列的测定 将DNA寄往英潍捷基（上海）贸易有限公司测序，然后将得到的DNA序列提交到 European Molecular Biology Laboratory（EMBL）核酸数据库。再将DNA序列通过Blast程序与Genebank中已有的核酸序列进行比较，确定菌株的分类地位。

1.4 菌株培养的生长条件确定

1.4.1 pH值的确定 采用苹果酸溶液调整培养基的pH值，测定耐热菌生长的pH值范围。配制pH分别为2.0～7.0的培养基，将标准耐热菌和各分离菌分别接种于不同pH值的培养基上，培养2～5 d观察其生长情况，初步确定菌株生长的pH值，再将其精确到0.1，将菌接种于微调后的不同pH值培养基中，培养2～5 d观察各菌的生长情况，最终确定各菌适宜生长的pH值。

1.4.2 生长温度的确定 液体培养基以苹果酸溶液酸化后分装试管，分别接入标准耐热菌和各分离菌的菌悬液，置于20～70℃不同温度条件下培养2～5d，观察培养液的浊度及液面产生的菌膜等生长特征，最初确定生长温度范围，再将此温度精确到1℃，再将菌置于微调后的不同温度下培养2～5 d观察各菌的生长情况，确定各菌的适宜生长温度。

1.5 标准耐热菌、分离菌生长曲线的确定

将标准菌和分离菌接入灭菌的液体培养基中，于41℃温度下培养，每隔2 h取样1次，测定菌体的吸光度值，观察30 h后，分别建立标准耐热菌和各分离菌在41℃温度下的生长曲线。

1.6 抑菌性的研究

1.6.1 单宁酸抑菌活性的测定 采用滤纸片法测定抑菌圈直径[16-17]：取直径为6 mm的灭菌滤纸片放入不同浓度的单宁酸溶液中浸泡过夜，另取滤纸片放入体积分数为20%乙醇溶液中作对比空白试验，将嗜酸耐热菌的菌悬液取100 μL与相应固体培养基制成含菌平板，再用无菌镊子夹取浸有各种浓度的单宁酸溶液的滤纸片，放入含菌平皿中，同一浓度每皿3片，做3个重复试验。按上述相应条件培养，量取抑菌圈直径，取平均值。观察结果确定单宁酸的抑菌效果。

1.6.2 最低抑菌质量浓度的测定 采用琼脂二倍稀释法[18-19]测定单宁酸对细菌的最低抑菌浓度（MIC）：另取乙醇溶液作为对照，记为0 mg/mL。每质量浓度样品各取2 mL放入不同平皿中，然后分别加入18 mL已灭菌并融化的固体培养基，立刻混匀，待培养基冷却凝固后，各加100 μL调至一定菌浓的菌菌悬液于对应琼脂平板上，划线，细菌于41℃恒温培养24 h，肉眼观察无细菌菌落形成的最小单宁浓度为最小抑菌浓度，每组重复3次。

2 结果与讨论

2.1 菌种的分离、纯化结果

通过分离、筛选及纯化，得到了2株嗜酸耐热菌，即分离菌1和分离菌2，分离获得到的这2株菌，在酸性K氏培养基上生长良好，但无法在LB培养基上生长，表明这两株菌均具有嗜酸性。均可经过80℃13 min的热处理后可很好生长，表明这两株菌具有耐热性。初步确定两者为嗜酸耐热菌。

经过3次纯化后的分离菌肉眼可见形态，分离菌的菌落形态为圆形，大小为1.5～3.3 mm，颜色为乳白色至浅黄色，表面光滑、有光泽、潮湿，无凸起，不透明，易挑取。两株分离菌的菌落形态特征与酸土环脂芽孢杆菌的标准菌落形态特性类似。

2.2 菌种的筛选结果

用BSSA培养基 （用于果汁中嗜酸耐热菌的检测）对分离菌进行筛选，结果为两株菌均可较好生长，进一步表明两株分离菌为嗜酸耐热菌。

2.3 菌种的鉴定结果

2.3.1 细胞形态鉴定结果 按1.3方法分离培养可以得到大量的耐热菌，这些耐热菌用通常的细菌检测方法难以检出，在41℃条件下常需2～3 d可形成明显的菌落。对分离得到的2株耐热菌进行革兰氏染色和光学显微镜观察，如图1和表2所示，标准耐热菌、分离菌1和分离菌2的细胞显微形态十分相似，为杆状。革兰氏染色结果表明，分离菌菌均为G+菌。

图1 各菌株繁殖体显微镜形态的观察结果（10×40）Fig.1 Micro-morphology of vegetative form（10×40）

表2 标准菌与分离菌的菌落与细胞形态特征Table 2 Colony and cell of standard strains and isolated strains

2.3.2 生理生化反应结果 标准菌、分离菌1和分离菌2的生理生化反应结果如表3所示，各项生理生化特性与标准相同。由此可见，这两株分离菌与标准菌株均由明显的相似性。

表3 标准菌与分离菌生理生化反应分析Table 3 Results of physiological characteristics

通过对菌种的形态观察和生理生化鉴定，可以得知2株分离菌与标准菌的各项指标相似，初步认为2株分离菌均属于环脂芽孢杆菌属。对分离的2株菌进行分子生物学分类鉴定，进一步确定其分类地位。

2.3.3 分子生物学鉴定 利用细菌试剂盒提取2株分离菌的DNA，电泳检测后进行PCR扩增，将PCR扩增产物进行测序。分离菌的DNA及PCR产物电泳图见图2。由图可知，PCR产物扩增之后得到的序列长度均在1 200 bp左右。

图2 DNA及PCR产物电泳图Fig. 2 DNA electrophoresis and PCR product electrophoresis

将得到的DNA序列提交到European Molecular Biology Laboratory（EMBL）核酸数据库。再将DNA序列通过Blast程序与Genebank中已有的核酸序列进行比较，得到标准菌与分离菌1，标准菌与分离菌2的序列同源性达到了99%，确定3种菌为同一种菌，为Alicyclobacillus acidoterrestris.（Alicyclobacillus acidoterrestris gene for 16S rRNA，strain：DSM 2 498下比对）

2.4 培养条件的确定

标准菌、各分离菌的培养条件见下表，各菌在25～55℃温度范围以及2.4～6.0的pH值范围内均能良好生长，且生长条件基本相同。均符合酸土环脂芽孢杆菌的特有嗜酸耐热的生长条件特性。

表4 各菌株培养的生长条件分析Table 4 Results of cultural characteristics

2.5 各菌株生长曲线结果

标准菌、各个分离菌的生长曲线见下图所示。由下图可见标准菌和分离菌的生长趋势较为一致。均在12 h后由调整期进入对数期，20 h时进入稳定生长期；当生长到26 h之后菌体浊度缓慢降低，步入衰亡期，三者有较高的类似性。

2.6 单宁酸的抑菌活性

单宁酸对嗜酸耐热菌有一定的抑菌作用，浓度越大，抑菌效果越明显。单宁酸产生抑制作用的主要原因有破坏细胞壁结构和改变细胞膜的通透性有关系[20]。

图3 耐热菌的生长曲线Fig.3 Growth curve of standard and isolated thermotolerant bacteria

2.7 单宁酸对嗜酸耐热菌的最低抑菌浓度

试验表明：单宁酸对嗜酸耐热菌有明显的抑菌效果，最低抑菌质量浓度为1.25 mg/mL。

3 结语

1）采用酸化的K氏培养基可以对柑橘中耐热菌进行有效地分离培养。各分离菌形态特征、生长及生理生化特性以及通过嗜酸耐热菌的选择培养基来看，初步鉴定分离菌为嗜酸耐热菌。经对所分离耐热菌的16S rDNA序列测定，鉴定出分离耐热菌为酸土环脂芽孢杆菌，且分离耐热菌与标准耐热菌的序列同源性达到了99%，分离得到的2株嗜酸耐热菌与标准菌有明显的相似性。

2）分离得到的两株可疑菌可在25～55℃温度范围以及2.4～6.0的pH值范围，符合嗜酸耐热菌的特点。

3）抑菌试验表明，单宁酸对嗜酸耐热菌有一定的抑菌作用，单宁酸的最低抑菌质量浓度为1.25 mg/mL，单宁酸有望成为天然食品抑菌剂。

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欧盟发布黄蓍胶作为食品添加剂的安全风险评估报告

2017年6月9日，欧盟委员会发布黄蓍胶作为食品添加剂的安全风险评估报告，根据“委员会条例（EU）”第257/ 2010号（EFSA ANS Panel，2014）重新评估某些食品添加剂的风险，并得出以下结论：

1.本评估仅限于报告的用途（70个食品类别中的5个）和使用量；

2.黄蓍胶不太可能被完整的吸收，并被肠道微生物部分发酵；

3.有充足的毒理数据可用；

4.对黄蓍胶的遗传毒性没有任何担忧（E413）;

5.最高剂量分别为6120和9120mg/kg，雌雄小鼠均未发现致癌作用；

6.口服每天摄入大量的黄蓍胶达2900mg（相当于每天141mg/kg体重）21天在人体中耐受性良好，没有任何不良影响报道。

综上，对于黄蓍胶（E413）作为报告中食品类别食品添加剂的用途和使用量评估，没有安全问题。

［信息来源］厦门WTO工作站.欧盟发布黄蓍胶作为食品添加剂的安全风险评估报告 [EB/OL].(2017-6-13).http:// www.xmtbt-sps.gov.cn/detail.asp?id=54603

Isolation，Identification and Antibacterial Effect by Tannic Acid of Thermoacidiphilic Bacteria From Citrus

LIU Yingsha1，2， LI Jianke*1， ZHANG Lin1， LIU Meihui1， SONG Bingbing1
（1.College of Food Engineering and Nutritional Science，Shanxi Normal University，Xi'an 710119，China；2. College of Biological Engineering，Yangling Vocational Technical College，Yangling 712100，China）

In order to provide methods to provent Thermoacidiphilic Bacteria From juice，we study the characteristics of Thermoacidiphilic Bacteria from citrus.The Thermoacidiphilic Bacteria which was isolated from the citrus was investigated by comparison with the standard strain using Kirin-medium acidified with malic acid.Different concentrations of tannic acid were tested in Thermoacidiphilic Bacteria from citrus.The minimal inhibitory concentration was measured through the agar dilution.The results shows the two polluted bacteria isolated from citrus can grow under the temperature of 25～55℃and pH of 2.4～6.0，which was corresponded with the characteristics of the Thermoacidiphilic Bacteria.Furthermore，the cellmorphology，colony morphology，cultural characteristics，physiological characteristics and 16S rDNA tests indicated the two isolated strains of Thermoacidiphilic Bacteria have obviously similar characteristics with the standard strain.Theresults showed that tannins had good antibacterial activities on thermoacidiphilic bacteria，MIC of which is 1.25 mg/mL.Isolates show a high degree of similarity with the standard strains.

Thermoacidiphilic Bacteria，citrus，tannic acid，antibacterial

S 666

：A

：1673—1689（2017）07—0767—06

2015-07-07

刘颖沙（1990—），女，陕西西安人，工学硕士，助教，主要从事营养与食品卫生学研究。 E-mail：18709233612@163.com

*通信作者：李建科（1960—），男，陕西西安人，教授，博士研究生导师，主要从事食品营养与安全研究。E-mail：jiankel@snnu.edu.cn

刘颖沙，李建科，张琳，等.柑橘汁中嗜酸耐热菌的分离、鉴定以及单宁酸对其抑菌作用研究[J].食品与生物技术学报，2017，36（07）：767-772.