邓 雪，胡雪原， 何 丹，晏子俊，周云莉， 张景勍

（重庆医科大学 药学院 /药物高校工程研究中心，重庆 400016）

静脉给予尿酸酶自组装空心纳米微球的药代动力学和生物等效性初步研究

邓 雪，胡雪原， 何 丹，晏子俊，周云莉， 张景勍*

（重庆医科大学 药学院 /药物高校工程研究中心，重庆 400016）

研究了载尿酸酶聚乙二醇-透明质酸 （Hyaluronic acid-graft-polyethylene glycol，HA-g-PEG）/磺丁基-β-环糊精（Sulfobutyl ether-beta-cyclodextrin，SCD）自组装空心纳米微球（HA-g-PEG/SCD self-assembly hollow spheres encapsulated uricase，UHPSD）在大鼠体内的药代动力学和生物等效性。大鼠单剂量静脉注射给予UHPSD和游离尿酸酶（Uricase，UOX），眼底静脉丛取血，测定给药后不同时间点大鼠血浆中尿酸酶的活性。采用DAS 2.1.1软件分析处理药动学数据，并对UHPSD和UOX进行生物等效性评价。UHPSD和UOX血药活性曲线符合二室模型。UHPSD提高了尿酸酶的生物利用度，UHPSD与UOX不具有生物等效性。

尿酸酶；自组装空心纳米微球；药代动力学；生物等效性

尿酸酶（Uricase，UOX）是生物体内嘌呤代谢途径中的关键酶，能够专一催化尿酸氧化生成尿囊素、过氧化氢和二氧化碳[1-2]，降低体内尿酸水平。人类和灵长类动物缺乏UOX，故可将其用于尿结石和肾病功能衰竭等所致高尿酸血症的治疗[3]。如Patte等[4]用从黄曲霉中制备的UOX治疗由白血病化疗引起的严重高尿酸血症。但是天然的UOX存在许多缺点：生理pH条件下活性低，稳定性差，体内活性半衰期短，机体易产生免疫反应以及易被体内酶水解失活[5]。因此，UOX的临床应用受到较大限制。

自组装空心纳米微球是一种新型的药物载体，具有生物膜相似性，提高被包封药物的稳定性，降低免疫原性和提高药物生物利用度等优点[6]。为了克服UOX的缺点，将UOX装载于聚乙二醇-透明质酸 （Hyaluronic acid-graft-poly ethylene glycol，HA-g-PEG）/磺丁基-β-环糊精 （Sulfobutyl etherbeta-cyclodextrin，SCD）形成的空心纳米微球中，形成尿酸酶自组装空心纳米微球 （HA-g-PEG/SCD self-assembly hollow spheres encapsulated uricase，UHPSD）。作者着重考察了UHPSD在大鼠体内的药动学过程，并对UHPSD和UOX进行生物等效性评价，为进一步研究UHPSD的药效提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

UOX，美国Sigma公司产品；尿酸，英国Alfa Aesar公司产品；磺丁基-β-环糊精：南京都莱生物技术有限公司产品。

AB204S电子分析天平：瑞士Mettler Toledo仪器公司产品；85-2型恒温磁力搅拌器：上海司乐仪器有限公司产品；TGL-16B台式高速离心机：上海安亭科学仪器厂产品；UV-7504 PC型紫外分光光度计，PHS-3C型pH计：上海精密科学仪器有限公司产品；Sephadex G-200层析柱：上海楷洋生物技术有限公司产品；清洁级SD大鼠：雄性，（230±20）g，中国人民解放军第三军医大学动物中心提供，动物合格证书：SCXK（渝）2012-0005。

1.2 试验方法

1.2.1 UHPSD的制备 按照Meng等[7]的方法，将1mg的UOX溶于2 mL的HA-g-PEG溶液 （质量分数1.0%）中，然后在搅拌的条件下，将2 mL含有UOX的HA-g-PEG溶液缓慢滴加入6 mL的SCD溶液（质量分数6.0%）中。开始滴加时，溶液变轻微的浑浊，表明开始有空心纳米球形成.继续在10℃条件下磁力搅拌2 h，即得UHPSD。

1.2.2 UHPSD包封率的测定 按照参考文献报道方法，采用葡聚糖凝胶柱色谱法[8]测定包封率。待Sephadex G-200柱填充与平衡后，吸取0.5 ml的UHPSD，上柱，用pH8.5的Bicine-NaOH缓冲液作为洗脱液洗脱分离UHPSD和UOX。取100 μL过柱后的UHPSD，加入乙醚破乳后，再加入考马斯亮蓝，在595 nm波长处测定吸收度值（A1）。以同法处理的未过柱的UHPSD，同法测定吸收度值（A2）。包封率（%）=（A1/A2）×100%，重复3次。

1.2.3 动物分组及给药 取雄性SD大鼠12只，按照简单随机方法分为2组，每组6只。一组静脉注射给予UOX（2U/Kg），另一组静脉给予UHPSD（相当于游离酶2U/Kg）。给药前禁食不禁水24 h，分别在给药 后 0.083、0.17、0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、10、12、24 h后，眼眶下静脉取血，置于肝素化离心管中，离心（6 000 r/min）10 min后分离血浆样品。

1.2.4 药时曲线的绘制 按照采用直接动力学尿酸酶法[9]测定UHPSD组和UOX组大鼠不同采血时间点血浆样品中酶的活性。根据所测结果，以时间为横坐标，酶活性为纵坐标，绘制平均血药活性-时间曲线。

1.2.5 药动学和生物等效性分析 用药代动力学计算程序 DAS 2.1.1拟合大鼠单次静脉注射UHPSD和UOX的经时血药浓度数据，Cmax及Tmax采用实测值，AUC0～24h、AUC0～∞和半衰期 t1/2为拟合数据。根据AUC0～24h计算UHPSD的平均相对生物利用度，即：平均相对生物利用度（F）=AUC（UHPSD）/ AUC（UOX）。再采用双向单侧t检验的统计量，求得（1-2α）置信区间。如在规定范围内（经对数转换后，UHPSD的 AUC0～24h在 UOX的 80%～125%范围，UHPSD的Cmax在UOX的70%-143%范围），即可有1-2α判断两者生物等效。检验水准α=0.05。

2 结果与讨论

2.1 UHPSD的包封率

制备3批UHPSD，经检测，平均包封率为（62.60±3.17）%。

2.2 药时曲线和药动学

2组雄性 SD大鼠分别静脉注射 UHPSD和UOX后，尿酸酶的药-时曲线见图1。UHPSD和UOX在SD大鼠体内的药代动力学参数见表1。

如图1所示，SD大鼠分别静脉注射UHPSD和UOX后，UOX组酶活性达到最高值后迅速下降。2 h时，UOX组大鼠血浆样品中检测不出酶的活性，而此时，UHPSD组大鼠血浆样品仍保留较高的酶活性（40.87 mU/L）。到达10 h时，UHPSD组大鼠血浆样品仍然能够检测到酶活性，且此时酶活性为本组最高活性的12.35%。实验结果表明，UHPSD延长了UOX在大鼠体内的滞留时间。

图1 SD大鼠静脉注射UHPSD和UOX后平均血药浓度-时间曲线Fig.1 Mean plasma concentration-time curve after injecting UHPSD and UOX in SD rats

如表1所示，UHPSD组和UOX组的t1/2分别为（8.35±5.95）h和 （0.89±0.25）h，t1/2延长了约8.38倍。Tmax分别为 （0.97±0.30）h和 （0.33± 0.00）h，Tmax明显延后。AUC0～24h分别为 （412.25± 34.87）mU·h/L和 （116.04±6.61）mU·h/L，AUC0～∞分别为（526.71±115.90）mU·h/L和（146.87±23.93）mU·h/L。经计算，UHPSD平均相对生物利用度F0-t为（355.27±30.05）%，UHPSD提高了UOX的相对生物利用度。

表1 SD大鼠静脉注射UHPSD和UOX后的主要药动学参数Table 1 Main pharmacoinetic parameters after injecting UHPSD and UOX in rats

2.3 生物等效性评价结果

经过 DAS2.1.1软件处理，AUC0-24h、AUC0-∞和Cmax经对数转换后进行双单侧t检验及90%可信区间考察，UHPSD和 UOX的 AUC0-24h之比为355.27%，置信区间为78.5%～81.2%；AUC0-∞之比为358.62%，置信区间为76.4%～79.4%；Cmax之比为50.90%，置信区间为104.3%～107.6%。双向单侧 t检验结果显示UHPSD与UOX的 AUC0-24h、AUC0-∞和Cmax具有显著性差异 （P＜0.05），Tmax经非参数秩和检验具有显著性差异（P＜0.05）。按照生物等效性判定标准，单次静脉注射UHPSD和UOX比较，两者不具有生物等效性。

3 结语

针对UOX存在生理pH条件下活性低；稳定性差，体内活性半衰期短；机体易产生免疫反应以及易被体内酶水解失活等缺点。Poznansky[10]等将尿酸酶与白蛋白进行交联；Yasuda[11]将尿酸酶吸附或以共价结合于壳聚糖或葡聚糖等。但是，以上方法都不能使尿酸酶发挥其最佳的催化活性，且大都存在生物相容性较低以及稳定性不理想等缺点。自组装空心纳米微球是一种新型的药物载体，具有缓释、降低药物毒性、提高药物稳定性等优点。经前期初步研究，将UOX包裹于HA-g-PEG/SCD自组装形成的空心纳米微球后，酶的体外稳定性获得了提高。

目前尚未见UHPSD的药物代谢动力学和生物等效性研究的相关报道。作者将UOX制备成UHPSD，酶以分子形式包裹于纳米微球中，不会泄露到体液中，从而到达长效、高效的目的。作者首次对UHPSD在大鼠体内的药代动力学和生物等效性进行了初步研究。结果表明UHPSD提高了酶的活性和生物利用度，延长了酶的t1/2和Tmax，缓释效果明显。UHPSD与UOX不具有生物等效性。

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会议名称(中文)：2017年全国植物生物学大会

所属学科：生物物理学、生物化学及分子生物学,细胞生物学,遗传与发育生物学,作物学及林木育种、生物学

开始日期：2017-10-09 结束日期：2017-10-10

所在城市：重庆市 渝中区

具体地点：重庆市 悦来国际会议中心

主办单位：中国细胞生物学学会、中国作物学会、中国植物学会、中国植物生理与植物分子生物学学会、中国遗传学会

协办单位：重庆大学、重庆市科协

承办单位：西南大学、重庆市植物学会、重庆市遗传学会、重庆市作物学会、中国科学院植物分子生理学重点实验室

主题：植物科学改善人类生活

会议主席：李家洋、许智宏、袁隆平

联系人：崔 强

联系电话：010-62836674

E-MAIL：cuiqiang@ibcas.ac.cn

会议网站：http://www.ncpb.net/2017/

会议背景介绍：为了展示我国植物生物学研究的最新成果和进展，促进植物科学改善人类生活，加强相关领域科研人员之间的交流与合作，中国细胞生物学学会、中国作物学会、中国植物学会、中国植物生理与植物分子生物学学会、中国遗传学会联合举办“2017全国植物生物学大会”。大会定于2017年10月9日-10日在重庆市召开。大会将邀请国内植物生物学相关领域取得突出成果并具有重要学术影响的专家学者以及优秀青年科学家进行学术报告。组委会诚挚邀请国内外同行参加本次大会。

Pharmacokinetics and Bioequiavailability of Intravenous Uricase Self-Assembly Hollow Nanospheres

DENG Xue， HU Xueyuan， HE Dan， YAN Zijun， ZHOU Yunli， ZHANG Jingqing*
（College of Pharmacy/Engineering Research Center in University，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

To study the pharmacokinetic and bioequivalence of hollow nanospheres self-assembled by hyaluronic acid-graft-poly（ethylene glycol）（HA-g-PEG）and sulfobutyl ether-beta-cyclodextrin（SCD）containing uricase（UHPSD）in SD rats.Rats were administrated with（i.v.）UHPSD and UOX，respectively.Blood sample were collected from eye socket，and the activity of uricase were assayed.Compartmental pharmacokinetics were analyzed by DAS 2.1.1 software，then the bioequivalence was judged.The activity-time curve of UHPSD and UOX were conformed to a two-compartment model with a lag time.

uricase，self-assembly hollow nanosphere，pharmacokinetics，bioequiavailability

R 91

：A

：1673—1689（2017）07—0698—04

2015-07-06

国家自然科学基金项目（30973645）；重庆市首批高等学校优秀人才资助计划。

*通信作者：张景勍（1973—），女，重庆人，教授，博士研究生导师，主要从事药物新剂型与新技术研究工作。E-mail：zjqrae01@163.com

邓雪，胡雪原，何丹，等.静脉给予尿酸酶自组装空心纳米微球的药代动力学和生物等效性初步研究[J].食品与生物技术学报，2017，36（07）：698-701.