尚敏敏， 赵永腾，赵 鹏， 李 涛，徐军伟， 余旭亚

（昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）

黄腐酸对Haematococcus pluvialis LUGU虾青素积累和lcy基因表达量的影响

尚敏敏， 赵永腾，赵 鹏， 李 涛，徐军伟， 余旭亚*

（昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500）

雨生红球藻是虾青素的主要来源，为探明黄腐酸 （FA）对雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU的影响，将不同质量浓度的FA添加至对数生长期的藻液中置于胁迫条件下培养，并分别对细胞生物量浓度、虾青素积累质量浓度以及番茄红素β-环化酶（lcy）基因表达量进行了测定。结果表明，黄腐酸质量浓度为10 mg/L，藻细胞的生物量产率达到最大80.28 mg/（L· d），比对照组提高5.44%；而虾青素最大质量浓度为20.82 mg/L，是在FA质量浓度为5 mg/L时测得，比对照组提高了86.89%。RT-PCR分析显示，虾青素合成的关键基因lcy的表达受FA的影响，当添加5 mg/L和10 mg/L的黄腐酸时lcy基因最大的表达量分别为对照的1.2倍和0.7倍。实验证明FA诱导下的雨生红球藻虾青素的积累含量和lcy基因表达量呈正相关。

黄腐酸；诱导；虾青素；lcy基因；雨生红球藻

雨生红球藻是自然界中普遍存在的一种单细胞绿藻，属于团藻目，红球藻科，红球藻属[1]，在不利的环境条件下藻细胞逐渐变大并积累虾青素[2]，且其虾青素的产量优于其他已知的虾青素来源[3-4]。雨生红球藻细胞内积累的虾青素是生物体天然次级代谢产物和强抗氧化物质，已作为添加剂广泛应用于水产养殖和食品领域[5-7]。但目前虾青素存在需求大，产量低、生产成本高等问题，因此，采取有效措施提高雨生红球藻虾青素的产量是解决这一问题的关键和研究热点。

Steinbrenner等[8]将雨生红球藻虾青素合成途径分为两个阶段：β-胡萝卜素的形成为第一阶段，虾青素的合成为第二阶段。番茄红素是类胡萝卜素中的一种，是类胡萝卜素生物合成途径中的重要的中间体，番茄红素β-环化酶基因是在雨生红球藻中虾青素合成途径中将番茄红素环化生成β-胡萝卜素的关键酶基因，β-胡萝卜素进而成为第二阶段合成虾青素的重要底物，lcy基因表达量的增加可以提高角黄质转化为虾青素的效率。黄腐酸（Fulvic Acid，FA）是一类成分复杂的天然有机物质[9]。陈玉玲等[10]在干旱条件下，冬小麦幼苗施加FA，发现其超氧物歧化酶SOD与过氧化物酶POD活性提高，植物抗干旱的能力增强。而FA作为诱导因子，对雨生红球藻中虾青素的积累影响和机理方面的研究还尚未见报道。

作者以雨生红球藻 Haematococcus pluvialis LUGU为对象，研究FA对Haematococcus pluvialis LUGU生长和虾青素积累的影响及FA胁迫对虾青素合成关键酶基因lcy表达的作用，为优化微藻培养条件、提高虾青素的产量、探索FA诱导其合成机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 雨生红球藻的培养

雨生红球藻Haematococcus pluvialis LUGU为作者所在实验室筛选、保存。利用BG-11为基础培养基，接种到3 L（内置2 L培养基）光生物反应器中，室内恒温（25±1）℃，光照强度2 800 lx，通入无菌空气进行高密度培养，直至培养到生长对数期。

1.2 黄腐酸的配制

根据预试验结果，实验共设置0，5，10 mg/L 3组质量浓度梯度的黄腐酸，每组设3个平行样，将对数生长期的藻细胞收集后重新悬浮，以2×105个/ mL的接种量接入诱导培养基中。每隔一天取样一次，测定H.pluvialis LUGU虾青素质量浓度。

1.3 虾青素质量浓度的测定

为了测定基础培养基中培养的 H.pluvialis LUGU虾青素的产量，采用Boussiba等[11]的方法稍加改进测定其虾青素含量。每隔一天定期取出5 mL处于诱导阶段的藻液，5 000 r/min离心5 min，弃上清液。于收集的藻细胞沉淀中加入质量分数5% KOH和体积分数30%甲醇混合液置于65°水浴锅内5 min以破坏叶绿素，5 000 r/min离心收集沉淀，加入3 mL二甲亚砜 （DMSO），利用超声波破壁（20 s/5 s，输出功率40 w），反复抽提直至藻体发白后，高速离心机10 000 r/min离心10 min，取上清液于490 nm下测定A值。按公式c（mg/L）=（4.5×A490× Va）/Vb计算虾青素质量浓度（A：吸光值，Va：DMSO的体积，Vb：藻液体积）。

1.4 雨生红球藻lcy基因表达分析

本实验由Primer 5.0软件设计，上海生工生物工程技术服务有限公司合成lcy酶基因的上下游扩增引物：5’-CTTCTTCTCCGCCTTCTTCA-3’与5’-GCATCCTACCGCTCAAAGAA-3’，扩增长度为565bp。扩增所得序列测序（上海生工）后BLAST比对，并以此为模板设计荧光定量引物 lcyF（5’-GACTGGAGTGGGAAGAAC-3’） 与 lcyR （5’-CCTACCGCTCAAAGAAATA-3’），目标产物为186bp。

Trizol法提取不同质量浓度FA处理的雨生红球藻RNA，利用逆转录试剂盒（TaKaRa）将RNA逆转录合成cDNA，以其为模板，以lcyF与lcyR分别为上下游引物进行RT-PCR扩增，检测不同质量浓度FA对雨生红球藻lcy基因表达的影响。通过ABI 7500荧光定量仪对lcy基因的表达进行定量，RT-PCR的数据结果用2-ΔΔCT的方法处理分析[12]。以18s（上游引物18sF：5’-CGGTCTGCCTCTGGTATG-3’，下游引物18sR：5’-GCTTGCTTTGAACACGCT-3’）基因作为内标以调节RNA的用量和循环数，使内标基因在不同浓度诱导下的表达丰度一致。

进行一元线性回归分析（回归方程中Y为虾青素质量浓度，x为lcy基因表达水平），研究不同质量浓度FA诱导下雨生红球藻虾青素质量浓度和lcy基因表达量之间的相关性。

2 结果与讨论

2.1 FA对诱导培养微藻细胞生长的影响

图1表明，不同质量浓度的FA对诱导阶段雨生红球藻细胞生长的影响存在差异，微藻细胞的生长量随着培养时间的延长而逐渐增加，培养至第3天后，添加FA的微藻细胞量都开始高于对照组。对照组和10 mg/L FA实验组在第7天生物量达到最大值；而FA质量浓度为10 mg/L时，生物量最大值提前出现在第5天。比较不同质量浓度FA胁迫下H.pluvialis LUGU的最大生物量（图2），结果显示，添加10 mg/L FA，细胞生物量达到最大值0.562 g/L。可见在诱导藻细胞阶段，适当质量浓度的FA能促进藻细胞的生长，且当黄腐酸的质量浓度为10 mg/L时，藻细胞的生物量产率达到最大80.28 mg/（L·d）。

图1 不同质量浓度黄腐酸对诱导阶段雨生红球藻LUGU藻细胞生长的影响Fig.1 Effect of different level of FA on the cell growth of H.pluvialis LUGU under induction period

2.2 FA对微藻总虾青素产量的影响

图3显示，不同质量浓度的FA对诱导阶段H. pluvialis LUGU内总虾青素质量浓度的影响存在差异，微藻总虾青素的质量浓度随着培养时间的延长而逐渐增加。当FA质量浓度为0～10 mg/L时，总虾青素产量呈对数增长。比较不同质量浓度FA胁迫下H.pluvialis LUGU总虾青素最大产量的变化（图4），结果发现，在不添加FA的条件下，总虾青素的产量为20.14 mg/g；当添加5 mg/L的FA时，总虾青素的产量提高了1.86倍；当FA质量浓度的增加到10 mg/L时，虾青素的产量仅为对照组的1.09，可见10 mg/L质量浓度的FA虽然促进了藻细胞的生长但却不利于虾青素的合成，不同质量浓度FA对虾青素积累的影响存在显著差异。

图2 不同质量浓度黄腐酸对雨生红球藻的最大生物量的影响Fig.2 Effect of different level of FA on the maximum cell growth of H.pluvialis LUGU under induction period

2.3 FA诱导下微藻虾青素产量和lcy基因表达量的关系

用RT-PCR的方法测定不同诱导时间内，不同浓度梯度FA诱导的H.pluvialis LUGU虾青素相关合成基因lcy的表达水平（图5），结合虾青素产量变化趋势，FA质量浓度为5 mg/L时，lcy的表达量至第7天达到最大值，为对照组表达量的1.2倍，虾青素产量至第7天达到最大值20.817 mg/g。FA质量浓度为10 mg/L时，虾青素产量至第7天达到最大值12.231 mg/g，lcy基因的表达量亦于第7天呈现出最大值，为对照的0.7倍。从不同FA质量浓度诱导H.pluvialis LUGU上来看，质量浓度为5 mg/L时，lcy基因表达量最大，这与该浓度下虾青素产量最大的结果一致。

不同浓度FA诱导H.pluvialis LUGU虾青素产量和lcy基因表达量之间的相关性表明，当lcy表达水平低时，微藻虾青素产量随其后表现出低产量；如lcy表达水平提高，虾青素的产量随之增加，两者呈现线性相关，回归方程为：y=0.058 5x+0.004 7，R2＝0.975 5（式中，y为H.pluvialis LUGU虾青素的产量，x为lcy基因的表达水平，直线方程的相关系数为0.975 5）。

图3 黄腐酸对雨生红球藻总虾青素产量的影响Fig.3 Effect of FA on the total astaxanthin production of H.pluvialis LUGU

图5 不同质量浓度的黄腐酸对lcy基因表达量的影响Fig.5 Effects of different level of FA on the transcript levels expression kinetics of lcy

3 结语

Raman等[13]利用不同的植物生长调节剂作为诱导子，诱导雨生红球藻大量积累虾青素。如将不同质量浓度的茉莉酸甲酯等加入到处于生长对数期的藻液中，再转入胁迫生长环境下诱导藻细胞积累虾青素，发现50 mg/L的茉莉酸甲酯大大缩短了微藻合成虾青素的时间，可有效促进雨生红球藻积累虾青素，但高浓度的诱导剂可能对藻细胞有毒害作用。Gao和Lu等皆利用不同质量浓度赤霉素A3诱导藻细胞积累虾青素，结果表明，赤霉素A3作为诱导剂可以提高虾青素的积累量，40 mg/L的赤霉素A3诱导藻细胞所积累的虾青素，高于20 mg/L和2 mg/L的赤霉素A3诱导的积累量[14-15]。因此，探究合适的诱导子和恰当的剂量是克服虾青素产量低的有效途径。Gao[16]研究了25 mg/L和50 mg/L的水杨酸分别对藻细胞积累虾青素与相关基因表达量的影响，基因与虾青素的积累正相关主要包括在转录前水平、转录水平及转录水平后；研究发现用25 mg/L诱导藻细胞时，lcy基因的表达量在第3天达到最高，早与藻细胞开始快速积累虾青素时间，表明这lcy在转录水平前对虾青素生物合成起到了正调节的作用。因此，研究诱导过程中虾青素代谢途径中相关基因的表达水平，有助于了解在添加黄腐酸的条件下虾青素产量提高的原因，为诱导虾青素积累提供理论基础。

黄腐酸是腐殖质中水溶性的一种天然物质，含有很多植物所需要的微量元素和氨基酸等，所含有的大量官能团生理活性比一般的植物生长激素生理能力强，还可以络合金属离子[9]，可作为植物生长因子促进植物的生长发育[17]。作为植物的一种拮抗剂，已有研究指出黄腐酸对于植物的抗倒伏、抗旱具有一定的作用[18-19]。添加外源黄腐酸可激发植物防御基因的表达，诱导植物的化学防御，促进相关化合物的合成。虾青素是雨生红球藻在胁迫条件下产生和积累的次生代谢产物，因此研究FA对雨生红球藻的生长以及虾青素积累的影响有较好的前景。

适宜质量浓度的FA有利于促进雨生红球藻H. pluvialis LUGU细胞的生长和虾青素的积累。FA添加质量浓度为10 mg/L，藻细胞的生物量产率达到最大80.28 mg/（L·d），比对照组提高5.44%。5 mg/L的FA，可诱导虾青素产量提高了1.86倍；且lcy表达量达到最大值，为对照组的1.2倍，微藻虾青素产量与lcy基因表达量成正相关。随着FA诱导虾青素生物合成的分子机制的进一步研究，FA有望成为产虾青素微藻的生物诱导子。

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Effects of Fulvic Acid on Astaxanthin Accumulation and the Transcript Levels Expression Kinetics of lcy Gene of Haematococcus pluvialis LUGU

SHANG Minmin， ZHAO Yongteng， ZHAO Peng， LI Tao， XU Junwei， YU Xuya*
（College of Life Science and Technology，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500，China）

To explore the effect of Fulvic acid （FA）on Haematococcus pluvialis，different concentration gradient of Fulvic acid（FA）was added in the culture of Haematococcus pluvialis LUGU.Meanwhile，cells growth，astaxanthin accumulation and the transcript levels expression kinetics of lcy gene was studied during induced time.The results show that the suitable concentration of FA not only promote the algae growth（when dealt with 10 mg L-1FA concentration，the algae biomass production reach the maximum 80.28 mg L-1d-1，increased by 5.44%than that of the control group），but also greatly improve the astaxanthin content（the astaxanthin content reach 20.82 mg L-1when dealt with 5 mg L-1FA concentration，is 86.89%higher than the control group）.RT-PCR analysis shows that the transcriptional levels of lcy induced by 5 mg L-1and 10 mg L-1FA is 1.2 and0.7 times than that of control，respectively.The correlation analysis indicate that，the accumulation of astaxanthin content and the transcriptional levels of lcy gene inducted by FA is positively correlated.

fulvic acid，induce，astaxanthin，lcy gene，Haematococcus pluvialis LUGU

Q 81

：A

：1673—1689（2017）07—0702—05

2015-07-07

国家自然科学基金项目（21266013）。

*通信作者：余旭亚（1969—），男，云南昆明人，工学博士，教授，主要从事生物质能工程研究。E-mail：xuya_yu@163.com

尚敏敏，赵永腾，赵鹏，等.黄腐酸对Haematococcus pluvialis LUGU虾青素积累和lcy基因表达量的影响[J].食品与生物技术学报，2017，36（07）：702-706.