孙 鑫，徐金标，魏军水

(台州市第一人民医院 口腔科，浙江 台州 318020)

健康科学基础研究

热处理提高钛种植体表面成骨细胞活性的实验研究

孙 鑫，徐金标，魏军水

(台州市第一人民医院 口腔科，浙江 台州 318020)

目的探讨热处理对提高钛金属种植体表面成骨细胞活性的影响。方法实验组将钛金属在700℃下退火1小时，从而在其表面形成一层TiO2生物活性层，对照组钛金属未经任何处理，采用扫描电镜和X射线衍射观察表面形貌及表面成分分析，并在钛金属种植体表面培养MG63成骨样细胞，观察热处理对钛金属植入体表面形貌、成分及MG63细胞增殖生长的影响。结果经700℃退火处理后，钛金属种植体的表面形貌未改变；实验组表面形成的金红石晶相二氧化钛薄膜的厚度较对照组薄，种植体表面MG63成骨细胞的增殖数量多于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论利用简单的热处理可以有效提高钛种植体的生物活性，提高其与基体骨组织的整合效率。

热处理；钛种植体；成骨细胞；骨整合效率

自从现代口腔种植学之父-瑞典生理学家Branemark教授在1952年发现钛金属与兔子胚骨能够牢固结合后，因钛金属具有良好的力学性能、生物相容性及耐腐蚀性能，已被广泛应用于骨科及口腔外科[1]。随着临床应用的日益广泛，如何通过对钛金属表面进行合适的改性，有利于细胞组织，尤其是成骨样细胞在其表面的附着生长，促进骨整合效率，是当前提高钛种植体临床应用效率的研究热点[2]。目前，使用较多的钛种植体表面改性方法是等离子喷涂和微弧氧化等方法[3]。等离子喷涂技术采用设备成本较高，且制备的涂层均匀性较差，易导致涂层脱落；微弧氧化法虽结合强度较高，紧密性较好，但工艺复杂，且机理尚不清楚[4]。本研究从改变钛金属植入体表面成分的思路出发，利用简单的热处理方法，对钛金属植入体表面进行改性，提高其生物活性，以提高钛种植体的临床应用。

1 材料和方法

1.1 实验材料 选用1cm × 1cm，厚度0.1cm的纯钛片10片，先用金相砂纸(从1500目到4000目)将其表面磨平，再用酒精和去离子水超声清洗机清洗后备用。

1.2 钛金属片热处理 将5片打磨后钛金属片(实验组)放在马弗炉中，常压下，设定升温速度为每分钟10℃，并在700℃条件下保温1h，自然冷却后取出用去离子水冲洗。对照组5片纯钛片不经任何处理。

1.3 观察指标及方法 利用扫描电子显微镜(Scanning electron microscopy, SEM， Hitachi bSU70)观察钛金属表面形貌，利用X射线衍射(X-ray diffraction, XRD, PANalytical XPert Pro)分析钛金属种植体表面成分；细胞增殖实验及MTS法测定吸光密度值(OD值)：采用成骨样细胞MG63(中科院上海细胞库)以约2.5×104/cm2的密度植入24孔板，每个孔板加入培养液0.5mL；培养72小时后，加入50μL MTS液，于37℃培养箱培养4h，用移液枪吸取120μL至96孔板测定其OD值。

1.4 统计学处理 将所得的实验数据采用SPSS19.0软件进行统计学处理，满足正态分布的计量资料以均数±标准差表示，采用t检验进行组间两两比较，等级资料、偏态分布资料组间比较采用秩和检验；P<0.05为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 钛金属表面形貌 SEM观察显示，两组经过金相砂纸打磨的实验组钛基板非常平整，在500倍放大倍数SEM条件下观察到明显的打磨痕迹(图1a)；而700℃退火处理过程对于钛金属表面形貌没有明显的改变(图1b)。

图1 对照组(a)和实验组(b)钛金属种植体表面SEM形貌图

2.2 钛金属种植体表面成分 进一步利用XRD分析两组钛金属表面成分，结果如图2所示，经过退火处理的钛金属表面形成一层二氧化钛薄膜；与标准卡片对比，可以分析得到的二氧化钛为金红石晶型结构(JCPDS No. 21-1276)，图2b中标出其对应衍射角度的晶面。从XRD衍射谱的结果还可以看到，钛种植体经过700℃退火处理，形成的金红石晶相二氧化钛薄膜的厚度薄(P<0.05)。

图2 对照组(a)和实验组(b)钛金属种植体表面的XRD成分分析图

2.3 钛金属表面细胞增殖情况 由表1和图3可以看出，经过700℃火处理的纯钛金属基板表面MG63成骨细胞的增殖数量增加了近17%，多于未处理样品的对照组表面，差异具有统计学意义(P<0.05)。

表1 两组钛金属种植体表面MG63成骨细胞增殖结果

图3 对照组(a)和实验组(b)钛金属种植体表面MG63成骨细胞增殖测试(MTS法)

3 讨论

目前，钛金属种植体的表面改性主要有两种思路：(1)物理改性，即改变其表面形貌、微观结构、粗糙度等物理性质。增强表面粗糙度有利于成骨细胞在其表面粘附和生长，同时，粗糙界面具有的更大表面积能促进新生的骨组织与宿主骨的结合强度。有研究表明，体外细胞培养的结果显示成骨细胞更有利于黏附在粗糙的表面结构，而且形状尺寸各不相同的细胞种类亦对种植体材料表面的粗糙度具有明显的感受差异。这是由于细胞外基质本身就是一个具有从微米到纳米尺度的尺寸分级结构，因此成骨细胞对微米级和纳米级的表面结构非常敏感，尤其对那些物理尺寸与细胞外基质中生物成分相匹配的表面微纳结构如空洞、颗粒等。还有研究表明，种植体表面的微纳结构粗糙度对细胞在种植体表面的黏附行为，即对种植体植入早期的生物学响应性影响较大。(2)化学改性，即改变钛金属体的表面成分，比如微量元素、生物活性涂层(羟基磷灰石、氧化钛等)和胶原蛋白等生物活性因子的引入，提高种植体表面的生物活性[5-6]。比如，羟基磷灰石是骨组织中无机组成中的主要成分，具有良好的生物相容性，且可以在羟基磷灰石上嫁接其他糖蛋白等生物活性因子，因此羟基磷灰石被广泛喷涂于钛种植体表面进行表面修饰。然而，羟基磷灰石在高温下喷涂时容易降解，且其与钛金属机体的热膨胀系数相差较大，在冷却过程中容易产生应力，出现涂层开裂脱落等种植失败现象。

这两种思路的目标都是希望利用简单低成本的方法，改善钛材料种植体普遍存在的生物活性差、与骨组织结合强度低以及愈合时间长等的问题，提高钛金属种植体表面生物活性，促进整合能力。本研究中将纯钛金属植入体经过简单的热处理，希望提高其表面生物活性。

由图1可知700℃火处理过程对于钛金属表面形貌没有明显的改变。说明可以排除由于退火处理可能导致的表面形貌的改变影响成骨细胞在两组钛金属表面增殖生长活性的可能性。另一方面，在种植体表面涂覆一层二氧化钛涂层，从而促进种植体的骨整合能力近年来逐渐引起大家的关注。首先，是因为二氧化钛具有良好的生物相容性。其表面具有丰富的羟基活性基团，这些羟基基团可以为钙离子以及磷酸根离子沉积提供结合位点，从而有效地促进羟基磷灰石的形成和新生骨组织的结合。有研究报道，利用阳极氧化法在钛金属表面制备二氧化钛纳米管，发现二氧化钛薄层不仅可以促进成骨细胞在其表面的粘附、增殖，同时还具有抗菌的能力[7]。所以，二氧化钛被认为是一种良好的钛金属种植体表面改性材料成分。更有研究表明，相对于其他晶体结构类型，金红石型的二氧化钛与血液、血浆蛋白以及纤维蛋白原之间的润湿性更好，表现出更加良好的生物活性。这是因为金红石晶相的二氧化钛晶体结构更有利于诱导磷灰石在其表面的形成，这与本实验的结果相吻合。另外，值得一提的是，用这种方法得到的二氧化钛生物活性涂层薄膜与钛金属机体的结合力很强，基本没有明显的界面。所以，即使在后续的动物体内实验研究中，也不会产生活性涂层薄膜脱落的现象，为后续的动物体内实验研究提供了力学结合强度的基础。其次，二氧化钛涂层与机体钛金属的化学组成较为相似，同时，其所具有的良好抗腐蚀能力可以有效地防止体液对机体钛种植体造成的长期腐蚀作用。因此，这样的一种二氧化钛活性涂层，其长期稳定性较之传统的利用等离子热喷涂、溶胶涂覆等方法制备的钛种植体表面生物活性涂层要稳定。

综上所述，通过简单的退火热处理过程，可以在钛种植体表面形成一层金红石晶相二氧化钛生物活性薄膜，从而显著提高其成骨细胞的增殖生长活性。且由于其是在钛种植体表面原位氧化得到的，与基体钛金属结合紧密，可有效提高钛种植体表面的耐磨性和耐腐蚀性。可以预见，实验组良好的体外成骨细胞增殖生长活性，可最终增强钛金属种植体与骨机体的整合效率。

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Effectofheattreatmentontheimprovementofosteoblastactivityonthesurfaceoftitaniumimplants

SUN Xin, XU Jin-biao, WEI Jun-shui

(DepartmentofStomatology,TaizhouFirstPeople’sHospital,Taizhou318020,China)

ObjectiveTo determine the effect of heat-treating on the improvement of osteoblast activity on the surface of titanium implants.MethodThe experimental group were treated with annealing at 700℃ for 1 hour so as to form a layer of TiO2 bioactivity on the surface of the titanium implants. The control group were not subjected to heat treatment. The surface morphology and surface composition analysis were observed by scanning electron microscopy (sem) and X-ray diffraction (XRD). The MG63 osteogenesis cells were cultivated on the surface of titanium implants training sample. The surface morphology, composition and growth of MG63 cell proliferation were observed after heat treating on the titanium implants.FindingsNo change was found on the surface of the titanium implants morphology after treatment with annealing at 700℃. The formation of the red crystal phase of titanium dioxide thin film of the experimental group was thinner than that of the control group (P<0.05). The MG63 osteoblasts proliferation on the surface of the experimental titanium planer wassignificantly more than that of the control group (P< 0.05) .ConclusionThe use of simple heat treatment can improve the bioactivity of the titanium planer and improve its integration with the matrix.

heat-treating；titanium implants；osteoblast cell

R783.1

：A

：1674-6449(2017)04-0393-03

2017-01-10

孙鑫(1977- )，男，辽宁海城人，本科，主治医师。

10.3969/j.issn.1674-6449.2017.04.010