冯英凯 王勇 黄正谷 赵小莉 刘英

·论著·

蛋白芯片技术与其他4种检测方法对结核病诊断价值的比较

冯英凯1王勇2黄正谷3赵小莉3刘英4

目的通过比较分析，评估蛋白芯片技术对结核病的诊断价值。方法选择655例结核病患者按病变部位分为肺结核组、肺外结核组和肺结核并肺外结核组，以非结核患者作为对照。应用蛋白芯片技术、γ-干扰素释放试验(TB-IGRA)、TB DNA的PCR检测法(TB-PCR)、集菌涂片法、结核菌培养法5种检测方法对各组样本进行同步平行检测，并比较蛋白芯片技术与其他4种方法的检测阳性率、灵敏度、特异度等。结果上述5种检测方法在结核组的阳性率均显著高于非结核对照组，结核组和非结核对照组分别为66.26%、16.53%(蛋白芯片技术)；91.30%、10.08%(TB-IGRA)；67.02%、30.24%(TB-PCR)；25.04%、0.00%(集菌涂片法)；25.65%、0.00%(结核菌培养法)，差异均有统计学意义。蛋白芯片技术对结核的检出阳性率及灵敏度显著高于集菌涂片法和结核菌培养法，与TB-PCR检测阳性率类似，显著低于TB-IGRA。蛋白芯片技术的特异度及阳性预测值显著高于TB-PCR，显著低于集菌涂片法和结核菌培养；特异度与TB-IGRA类似，阳性预测值显著低于TB-IGRA；阴性预测值与TB-PCR阳性率类似，显著高于集菌涂片法和结核菌培养法，显著低于TB-IGRA，差异均有统计学意义(P<0.05)。结论蛋白芯片技术和TB-IGRA作为诊断结核敏感度及特异度均较高的检测技术，二者取长补短，优势互补，具有良好的临床应用价值。

结核病； 蛋白芯片； γ-干扰素释放试验； 诊断价值

结核病严重危害人类健康，是我国重点控制的重大疾病之一，也是全球关注的公共卫生问题和社会问题[1-3]。早发现、早检查、早诊断、早治疗对确保治疗效果和改善病情转归起关键作用。本研究对蛋白芯片技术、γ-干扰素释放试验(TB-interferon gamma release assay, TB-IGRA)、TB DNA的PCR检测法(TB-PCR)、集菌涂片法、结核菌培养法等几种常用的结核检测指标进行平行对比分析，旨在评估上述5种检测方法对结核病的诊断价值。

资料与方法

一、研究对象

收集2013年7月至2016年7月三年间在重庆市公共卫生医疗救治中心门诊及住院的结核病患者655例及同期248例非结核病患者病例资料，平均年龄(40.29±18.47)岁，男性372例，女性206例。肺结核诊断依据国家卫生部《WS288-2008肺结核诊断标准》，肺外结核诊断参照文献[4-5]。研究分为肺结核组432例、肺外结核组146例、肺结核并肺外非结核组77例和非结核组对照组248例。其中肺外结核组包括结核性胸膜炎94例、结核性腹膜炎21例、结核性心包炎4例、结核性脑膜炎3例、淋巴结核9例、骨关节结核9例、肾结核6例；肺结核并肺外结核组包括伴结核性胸膜炎35例、结核性腹膜炎3例、淋巴结结核25例，骨关节结核14例；非结核对照组包括急性扁桃体炎21例，急性支气管炎65例，肺炎35例，泌尿系感染40例，慢性支气管炎13例，慢性阻塞性肺疾病56例，支气管扩张18例。所有研究对象均无HIV感染、妊娠、使用免疫抑制剂或增强剂。结核组与非结核对照组组之间具有可比性。初治行2HRZE/4H3R3方案；观察期间复发者用2SHRZE/6H3R3E3方案治疗。治疗前留取肺结核、肺外结核相应标本(静脉血、痰液、胸腔积液、关节液等)，分别行蛋白芯片技术、TB-IGRA、TB-PCR、集菌涂片法、结核菌培养法同步平行检测。

二、研究方法

1. 仪器与试剂：PBT-X2蛋白芯片阅读仪及结核分支杆菌IgG抗体检测试剂盒(蛋白芯片) (南京大渊生物技术工程有限公司)；人TB-IGRA酶联免疫分析试剂盒(QuantiFERON-TB Gold)[德国凯杰公司(QIAGEN)]；CFX96实时荧光PCR检测系统(BIO-RAD，美国)；结核分支杆菌(tuberculosis, TB)核酸扩增(polymerase chain reaction, PCR)荧光检测试剂盒(深圳市匹基生物工程有限公司)；罗氏培养基(珠海市银科医学工程股份有限公司)。

2. 蛋白芯片技术：遵照结核分支杆菌IgG抗体检测试剂盒(蛋白芯片)说明书提供的样本要求和试验方法进行操作。

3. TB-IGRA检测：遵照人TB-IGRA酶联免疫分析试剂盒使用说明书进行。结果判定标准：设定待测样品孔(T)含量值=a，空白孔(N)含量值=b，标准孔(P)含量值=c。若b≤400，实验有意义；当a-b≥14，并且≥25%b，不管c-b为任何值，均为阳性；当a-b≥14，但<25%b，或<14时，此时c-b≥20均为阴性；若a-b<14，c-b<20或a-b≥14，但<25%b，且c-b<20时，实验结果为不确定。最后结果以阳性、阴性及不确定三种定性方式表达。

4. TB-PCR：痰标本在经过处理后进行DNA提取，采用聚合酶链反应方式进行检查，模板每扩增一次，就会有一次荧光信号产生，通过荧光信号的监测确定模板定量。遵照TB PCR荧光检测试剂盒说明书进行。

5. 集菌涂片法检测：应用萋-尼法进行抗酸染色[6]。

6. 结核菌培养：应用改良罗氏培养法，按《改良罗氏结核杆菌液体培养基使用说明书》进行。

三、统计学方法

采用SPSS10.0软件进行统计学处理。率的比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、蛋白芯片技术与其他4种检测技术的阳性率比较

5种检测方法在结核组的阳性率均显著高于非结核对照组(均P<0.05)，差异有统计学意义。蛋白芯片技术对结核的检出阳性率显著高于集菌涂片法和结核菌培养法(均P<0.05)，与TB DNA的PCR检测阳性率类似，显著低于TB-IGRA(P<0.05)。蛋白芯片技术与TB-PCR在肺结核组和肺外结核组的阳性率差异不显著。集菌涂片法对肺结核的检出率显著大于肺外结核(均P<0.05)，见表1。

表1 蛋白芯片技术与其他4种检测技术的阳性率比较

注：与非结核对照组比较，aP<0.05；与蛋白芯片技术比较，bP<0.05；与肺外结核组比较，cP<0.05

二、蛋白芯片技术与其他方法学的灵敏度、特异度比较

比较5种方法检测的灵敏度、特异度、阳性预测值及阴性预测值估计值的95%置信区间，结果显示：①蛋白芯片技术的灵敏度显著高于集菌涂片法和结核菌培养法(均P<0.05)，与TB-PCR阳性率类似，显著低于TB-IGRA(P<0.05)，差异均有统计学意义；②蛋白芯片技术的特异度及阳性预测值显著高于TB-PCR(均P<0.05)，显著低于集菌涂片法和结核菌培养法(均P<0.05)；特异度与TB-IGRA类似，阳性预测值显著低于TB-IGRA；③蛋白芯片技术的阴性预测值与TB-PCR阳性率类似，显著高于集菌涂片法和结核菌培养法，显著低于TB-IGRA，差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表2 蛋白芯片技术与其他方法学检测的灵敏度、特异度比较

注：与蛋白芯片技术比较，aP<0.05

三、蛋白芯片技术与TB-IGRA在肺结核组和肺外结核组的灵敏度、特异度比较

通过统计学分析蛋白芯片技术与TB-IGRA 2种方法在肺结核组和肺外结核组的检测灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及约登指数估计值的95%置信区间，结果显示：无论对肺结核还是肺外结核，蛋白芯片技术对结核检出的灵敏度、阳性预测值、阴性预测值及约登指数均显著低于TB-IGRA法的对应检测(均P<0.05)；2种方法对肺结核组和肺外结核检出的特异度类似，差异无统计学意义，见表3。

表3 蛋白芯片技术与TB-IGRA的灵敏度、特异度比较

注：与蛋白芯片技术比较，aP<0.05

讨 论

尽管目前诊断结核病的技术方法和指标众多，但仍缺乏方便、快捷、有效、价廉的判断方法和指标，主要依赖多指标检测及临床综合评估。传统的检测手段如影像学检查和痰菌(涂片或培养)检查分别存在客观性差、滞后性(时效性差)、阳性率低(敏感度差)等缺陷。 选择一种或几种特异性强、敏感度高，并与涂片阳性结果有良好相关性的实验室指标，能更好、更快地早期诊断结核病，从而采用最佳治疗方案，改善结核预后、提高治愈率已成为当前研究的方向。近年来，有许多免疫学、分子生物学试验用于结核病的早期诊断，如RNA恒温扩增实时检测技术应用于病原体的核酸诊断等，而蛋白芯片技术及干扰素释放试验尤其值得关注[7-10]。

本研究应用蛋白芯片技术、TB-IGRA、TB-PCR、集菌涂片法、结核菌培养法对肺结核组、肺外结核组和肺结核并肺外结核组、非结核对照组等各组样本进行同步平行检测，并比较蛋白芯片技术与其他4种方法的检测阳性率、灵敏度、特异度等。结果发现，上述5种检测方法在结核组的阳性率均显著高于非结核对照组，差异均有统计学意义。蛋白芯片技术对结核的检出阳性率及灵敏度显著高于集菌涂片法和结核菌培养法，与TB-PCR检测阳性率类似，显著低于TB-IGRA。蛋白芯片技术的特异度及阳性预测值显著高于TB-PCR，显著低于集菌涂片法和结核菌培养法；特异度与TB-IGRA类似，阳性预测值显著低于TB-IGRA；阴性预测值与TB-PCR阳性率类似，显著高于集菌涂片法和结核菌培养法，显著低于TB-IGRA，差异均有统计学意义。

结核分支杆菌相对分子质量16×103蛋白、38×103蛋白及脂阿拉伯甘露聚糖LAM 3种抗原均为结核分支杆菌特异性较高的抗原，具有较强的免疫原性，适用于结核病的血清学诊断。一般免疫学诊断方法大都采用上述抗原之一，而蛋白芯片技术同时用上述3种抗原进行检测，系将上述3种抗原同时固定在微孔滤膜载体上，捕捉被检样品中特异性抗体，抗原-抗体反应形成的抗原-抗体复合物，再与胶体金标记的兔抗人IgG结合，在膜上形成紫红色斑点。通过芯片识别系统分析结果，实现了上述3种抗体的同步检测，其中一种阳性即确定检测结果为阳性。该方法提高了检测的阳性率，具有高通量、高灵敏度、高特异性且微型化的特点，整个检测过程不超过30 min。

蛋白芯片技术研究多集中于通过检测结核菌抗体实现结核病早期诊断，具有简便、快速、准确，敏感性较高、特异性强和检测成本低等优点，是临床辅助诊断结核病的有效方法，并作为结核病耐药检测试验，在临床上已得到广泛应用[11-16]。

TB-IGRA测定原理系应用双抗体夹心法测定人结核分支杆菌γ-干扰素水平。用纯化的人结核分支杆菌γ-干扰素抗体包被微孔板，制成的固相抗体与标本中TB-IGRA结合，后者再与HRP标记的结核分支杆菌γ-干扰素抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，洗涤后加底物TMB显色。测定450 nm波长下吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中人结核分支杆菌γ-干扰素浓度。根据判定标准确定为阳性或阴性。

尽管有研究表明TB-IGRA对于诊断儿童肺结核的敏感度具有一定参考价值，但TB-IGRA单独用于诊断活动性结核病尚缺乏充足的临床证据支持。TB-IGRA诊断活动性结核敏感度高于结核菌素(old tuberculin, OT)、纯蛋白衍生物皮试(pure protein derivative skin test, PPD)，但其特异度较低，会导致部分患者被误诊为活动性结核。

综上所述，蛋白芯片技术和TB-IGRA作为诊断结核敏感度及特异度均较高的检测技术，二者取长补短，优势互补，优于其他检测方法，具有良好的诊断价值，并可用作抗结核疗效监测的备选方法。

1 杨春娥, 冯喜英. 结核病易感基因的研究现状[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2016, 9(2): 207-209.

2 龚新记, 李月华, 姚丽丹, 等. MLVA用于新疆部分地区结核分枝杆菌基因分型的初步研究[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版), 2017, 10(3): 304-308.

3 Mesquita ED, Gil-Santana L, Ramalho D, et al. Associations between systemic inflammation, mycobacterial loads in sputum and radiological improvement after treatment initiation in pulmonary TB patients from Brazil: a prospective cohort study[J]. BMC Infec Dis, 2016, 16: 368.

4 江红, 臧国庆. 肺外结核[J]. 中华全科医学, 2012, 10(1): 103-104.

5 许绍发, 端木宏谨. 肺外结核的诊断和治疗[J]. 中华结核和呼吸杂志, 1997, 20(3): 131-132.

6 陆震宇, 杨明芳, 陈纬. 结核病实验室诊断技术评价及其研究进展[J]. 中国卫生检验杂志, 2017, 27(2): 301-304.

7 申明莉, 王玉华. SAT技术用于快速检测肺结核的临床意义[J]. 中国继续医学教育, 2016, 8(9): 18-20.

8 王静, 刘立宾, 岳永宁, 等. RNA恒温扩增实时检测技术与荧光定量PCR联合检测肺泡灌洗液对痰涂阴性肺结核的快速诊断价值[J]. 中华医院感染学杂志, 2017, 27(2): 300-304.

9 王长征, 张平安, 梅冰, 等. γ-干扰素释放试验在肺结核诊断中的应用[J]. 公共卫生与预防医学, 2015, 26(1): 49-52.

10 李锋, 卢水华. γ干扰素释放试验在儿童结核病和潜伏结核感染中的诊断价值[J]. 中国防痨杂志, 2015, 37(7): 732-735.

11 何启军, 姚敏, 吴多荣. 蛋白芯片技术诊断结核病的评价[J]. 中国热带医学, 2010, 10(5): 523-524.

12 张立群, 王云霞, 周敏, 等. 4种不同结核分支杆菌检测方法对结核病的诊断价值比较[J]. 中华医院感染学杂志, 2010, 20(11): 1633-1635.

13 吴友根, 杨兴萍, 王军, 等. 结核蛋白芯片检测诊断结核病的价值[J]. 中国感染与化疗杂志, 2014, 3: 196-198.

14 张仁卿, 邓长国. 结核蛋白芯片检测对结核病的诊断价值[J]. 四川医学, 2016, 37(10): 1140-1143.

15 Zhu L, Liu Q, Martinez L, et al. Diagnostic value of GeneChip for detection of resistantMycobacteriumtuberculosisin patients with differing treatment histories[J]. J Clin Microbiol, 2015, 53(1): 131-135.

16 杜秀然, 李春霞, 刘锐, 等. 结核生物蛋白芯片技术对肺结核的诊断价值[J]. 河北医药, 2015, 1: 40-42.

(本文编辑：张大春)

冯英凯，王勇，黄正谷，等. 蛋白芯片技术与其他4种检测方法对结核病诊断价值的比较[J/CD]. 中华肺部疾病杂志(电子版)， 2017， 10(4)： 427-430.

Comparative analysis of clinical values of protein chip technique and other 4 detection methods for the diagnosis of tuberculosis

FengYingkai1,WangYong2,HuangZhenggu3,ZhaoXiaoli3,LiuYing4.

1DepartmentofRespiratoryMedicine,DaomenkouBranch,ChongqingHospitalofTraditionalChineseMedicine,Chongqing400011China;2GeneralInternalDepartment,ChongqingInfectiousDiseaseMedicalCenter,Chongqing400036China;3DepartmentofLaboratoryMedicine,ChongqingInfectiousDiseaseMedicalCenter,Chongqing400036China;4ChongqingTuberculosisControlCenter,Chongqing400050China

Correspondingauthor：FengYingkai,Email:fykme@163.com

Objective To evaluate the value of protein chip technique in the diagnosis of tuberculosis by comparative analysis. Methods According to lesion distribution, a total of 655 patients with tuberculosis were divided into three groups: pulmonary tuberculosis group, extrapulmonary tuberculosis group, and pulmonary&extrapulmonary tuberculosis group, with non-tuberculosis patients as the control group. Protein chip technique, TB-interferon gamma release assay (TB-IGRA), PCR assay for TB DNA(TB-PCR), bacteria-collecting smear method and bacterial culture method were applied to synchronous parallel detection for each group of samples. The positive detection rate, sensitivity and specificity of protein chip technique were compared with those of other 4 kinds of methods. Results The results showed that the positive rates of the 5 detection methods in tuberculosis group were significantly higher than those in non-tuberculosis control group. control group, 66.26%vs. 16.53% (protein chip technique); 91.30%vs. 10.08% (TB-IGRA); 67.02%vs. 30.24% (TB-PCR); 25.04%vs. 0% (bacteria-collecting smear method); and 25.65%vs. 0% (bacterial culture method). The differences were statistically significant (P<0.05). The positive rate and sensitivity of the detection of tuberculosis by protein chip technique was significantly higher than that of bacteria-collecting smear method and culture method, and the positive rate of TB detection was similar to that of TB-PCR, which was significantly lower than that of TB-IGRA. The specificity and positive predictive value of protein chip technique were significantly higher than those of TB-PCR, significantly lower than those of bacteria-collecting smear method and bacterial culture. As compared with TB-IGRA, protein chip technique was similar in specificity, positive predictive value was significantly lower. The negative predictive value of protein chip technique was significantly higher than that of TB-PCR, smear and bacterial culture, significantly lower than that of TB-IGRA, and the differences were statistically significant (P<0.05). Conclusion As the diagnostic techniques of tuberculosis with higher sensitivity and higher specificity, protein chip technique and TB-IGRA have complementary advantages and a good clinical application value.

Tuberculosis; Protein chip; Interferon gamma release assay; Diagnosis value

10.3877/cma.j.issn.1674-6902.2017.04.012

重庆市卫生和计划生育委员会医学科研重点项目(2013-1-038)

400011 重庆，重庆市中医院道门口院部呼吸内科1400036 重庆，重庆市公共卫生医疗救治中心普内科2、检验科3400050 重庆，重庆市结核病防治所4

冯英凯， Email：fykme@163.com

R562

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2017-05-12)