胡 玉

(河南省基础教育教学研究室 郑州 450016)

自20世纪70年代诞生以来，基因工程已经成为生命科学中最具活力的前沿领域之一。引导学生深入理解基因工程的基本原理和技术流程，了解基因工程在农业、医疗、环境保护等方面的广泛应用及发展前景，可较好地拓展学生的科技视野、增强学生的科技意识，尤其是对那些有志于从事生物科学研究的学生，更显得至关重要。但是，这部分内容比较抽象，有一定难度。

现以人教版选修教材中基因工程的部分内容为例，探讨在实际教学过程中两个常见难点的解决策略。

1 关于“利用PCR技术获取目的基因”

如何利用PCR技术从大量DNA分子中获取目的基因？对于我们需要的目的基因，必须知道该基因两端的部分碱基序列，否则是不能利用这种方法获取目的基因的。根据基因两端的已知序列，合成相应引物，利用该引物扩增目的基因。只有特定的引物，才能扩增出特定的DNA片段(目的基因)。由于学生对于PCR技术的原理及过程可能并不熟悉，对于引物的作用就不能理解。所以，有必要先讲解PCR技术的原理及反应过程。

1.1 介绍引物及其作用 DNA聚合酶(PCR中为Taq酶)只能从脱氧核苷酸链的一端添加单个脱氧核苷酸，而不能直接起始一条新链。要扩增DNA分子中的一个基因，至少要知道该基因两端的部分碱基序列，以便于根据已知序列设计引物(能和基因两端已知序列进行碱基配对的短的脱氧核苷酸链)。由于DNA聚合酶只能从3′—OH端添加单个脱氧核苷酸，所以设计的引物对应该分别和待扩增基因两条链已知序列的5′—OH端互补结合，以便于在DNA聚合酶的作用下，使单个脱氧核苷酸从引物的3′—OH端添加上去，使新合成的链沿5′—OH→3′—OH方向延伸。

反应体系中要一次性加入足量的引物(足够30～40次循环)、足量的dNTP(即：dATP、dCTP、dGTP、dTTP，“d”代表“脱氧”；“T”代表“三个”；“P”代表“磷酸”“A、C、G、T”分别代表四种含氮碱基，它们是分别由四种普通的脱氧核苷酸在消耗ATP的基础上活化而成的)，中间不需要再次加入。

1.2 介绍PCR过程 ①变性(90℃～95℃)：DNA模板在加热作用下，碱基对之间的氢键断裂，形成两条单链；②复性(退火)(55℃～65℃)：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链；③延伸：(70℃～75℃)：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的子链。

图1 聚合酶链式反应(PCR)体外扩增 DNA技术的基本原理[1]

结合图1介绍PCR过程之后，提出问题：利用PCR技术扩增目的基因，引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础。现加入含有目的基因的DNA分子、引物对A、B(分别和目的基因两条链的5′端结合)、dNTP及其他必需物质进行PCR，在第几轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段(目的基因)？第四轮循环结束后，产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为多少？

这个问题需要学生结合图1进行思考，在这个过程中，他们能较好地理解PCR过程中复性时引物与模板链5′端的结合情况，以及目的基因到底是如何被克隆出来的。PCR扩增DNA片段的特异性是由一对引物所决定的。反应初期，原来的DNA担负起模板的作用，随着循环次数的递增，由引物介导延伸的片段急剧增多而成为主要模板，最终的扩增产物是介于两种引物5′—OH端之间的DNA片段(即目的基因)。

经过这个过程的学习，学生能够非常清晰地认识到如何通过PCR技术，从DNA分子上扩增出目的基因的过程。

2 关于“目的基因的运载体”

关于“目的基因的运载体”，教材只是重点介绍了质粒这种载体，充当载体的质粒需要满足的条件和理由没有进一步解释；对其他载体与质粒的差别没有进行描述；对于天然质粒的改造问题，教材没有描述，后面构建表达载体也没提及，学生不知其中的缘由。

对于这部分内容，学生最多的疑问如下：λ噬菌体的衍生物是什么？人工改造质粒是如何进行的？改造的目的是什么？因此，在教学过程中，这几个问题有必要讲解清楚，建议补充以下内容。

λ噬菌体基因组有60多个以上基因，其中有一半左右参与了噬菌体生命周期的活动，这些基因所在区段是噬菌体生长繁殖所必需的，在表达载体构建中为不可替代区；而另一部分基因对于噬菌体生长周期不是必需的，这些基因所在区域就称为可替代区，如果用外源基因取代之后，并不影响噬菌体的生命功能，正是这一特点构成了λ噬菌体作为外源基因表达载体的基础。野生型λ噬菌体DNA必须经过改造才能成为理想的载体，其构建过程主要有：①删除基因组中非必需区，建立外源DNA片段的替换点，增加承载外源DNA片段的容量；②在非必需区内插入或替换选择的标记基因和目的基因；③建立重组λDNA分子的体外包装系统，使之有效地感染受体细胞。简而言之，将目的基因插入或替换进入病毒基因组的可替代区，再利用病毒的侵染性,将目的基因导入受体细胞，这就是病毒作为“分子运输车”的基本机理。

由于野生型λ噬菌体DNA对大多数目前在分子克隆中常用的限制酶有多个切点，而且有些位点恰巧定位于与噬菌体生长繁殖关系密切的必需基因之中，这些位点的剪切重组必然严重影响噬菌体的繁殖。因此，野生型λDNA不能直接用作载体而需经过改造才能成为有价值的克隆载体。天然λ噬菌体载体改造的关键是去除或改变其基因组必需区段内多余的限制酶切位点。改造方法包括点突变、基因组的置换和缺失。由天然λ噬菌体改造获得的就是λ噬菌体的衍生物。

天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。

现在常用的质粒，都是早期利用天然质粒经历多次改造而成的：如添加抗生素抗性基因(作为标记基因，便于筛选转化成功的细菌)、添加 MCS (多克隆位点)区域等。所谓添加MCS，是质粒中的一段碱基序列，由数个酶切位点组成，这些位点在载体上都是单一位点[1]。