陈玉文 福州大北农生物技术有限公司福州350014

不同接毒方法对猪圆环病毒2型增殖的影响

陈玉文 福州大北农生物技术有限公司福州350014

本试验对比了不同的接毒方法，观察猪圆环病毒2型的繁殖情况。试验分为同步接毒（A组、B组）和异步接毒（C组、D组）：同步接毒A组为在消化分装好的细胞悬液中同步接入5%（V/V）的PCV2种毒，B组为在消化分装好的细胞悬液中同步接入3%（V/V）的PCV2种毒，24 h后再接种2%种毒；异步接毒C组为在生长良好、培养24 h的单层细胞中接种5%（V/V）的PCV2种毒，D组为在生长良好、培养48 h的PK15单层细胞中接种5%（V/V）的PCV2种毒。四组均在接种后培养72 h收获，进行病毒含量检测。试验结果显示：A组的病毒含量为107.0～7.25TCID50/mL，B组病毒含量为106.75～7.0TCID50/mL，C组的病毒含量为106.4～6.5TCID50/mL，D组的病毒含量为106.25～6.5TCID50/mL。试验结果表明，采用同步接毒法的病毒含量明显高于异步接毒法，在细胞悬液中同步一次性接入5%种毒，病毒的增殖量最高。

猪圆环病毒2型同步接毒异步接毒病毒含量

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus 2，PCV2）主要引起断乳仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎-肾病综合征（PDNS）、增生性坏死性肺炎（PNP）、猪呼吸道疾病综合征（PRDC）、繁殖障碍、肠炎、仔猪先天性震颤等，其中以PMWS最为严重。该病毒在各养猪国家广泛流行，与PCV2感染相关的猪，其病死率10%～30%不等，较严重的猪场在暴发该病时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失，受到国内外学者的高度重视，对该病的研究特别是对其疫苗的研究正日益受到关注。PCV2属圆环病毒科（Circoviridae）圆环病毒属（Circovirus），是一种小而无囊膜、二十面体、共价闭合、环状的单股DNA病毒，病毒粒子直径平均为17 nm，分子量为0.58× 106Da，是目前发现的最小的动物病毒[1]。PCV2适于在具有旺盛增殖能力并处于有丝分裂过程中的细胞上复制，其DNA的复制依赖细胞周期中S期表达的细胞蛋白[2]。PCV2在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK-21细胞以及一些猪传代细胞系（PT、PET）上不能生长。PCV2可在PK15细胞上良好生长，把PCV2接种到无PCV污染的单层PK15细胞上能够获得较好的病毒复制增殖，但不产生细胞病变。本研究通过不同接毒方法对猪圆环病毒2型在PK-15细胞上的增殖试验，进而为生产猪圆环病毒2型灭活疫苗过程中提高病毒培养滴度提供参考。

1 材料与试剂

1.1 细胞、毒株PK15细胞和PCV2（DBN-SX07株）由福州大北农生物技术有限公司保存、提供。种毒的毒价为106.5TCID50/mL。

1.2 主要试剂MEM培养基和新生牛血清购自GIBCO公司；D-氨基葡萄糖购自SIGMA公司。

2 方法与步骤

2.1 细胞准备选择1瓶细胞状态良好、培养72 h的健康PK15细胞，用0.25%胰酶进行消化，消化后按一定的比例进行分装，分装至T75方瓶中，共分装8瓶等量的细胞，随机选取其中4瓶置CO2培养箱中37℃继续培养，用于异步接毒，另4瓶用于同步接毒。

2.2 试验分组

2.2.1 同步接毒A组取消化分装好的PK15细胞悬液2瓶，按5%（V/V）的接种量接种PCV2（DBN-SX07株）种毒，置37℃下培养24 h后，弃去生长液，加入含2%新生牛血清和3 mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，置37℃下继续培养48 h后收获。

2.2.2 同步接毒B组取消化分装好的PK15细胞悬液2瓶，按3%（V/V）的接种量接种PCV2（DBNSX07株）种毒，置37℃下培养24 h后，弃去生长液，加入含2%新生牛血清和3 mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，同时按2%（V/V）的接种量接种PCV2（DBN-SX07株）种毒，置37℃下继续培养48 h后收获。

2.2.3 异步接毒C组选取生长良好培养24 h的PK15单层细胞2瓶，弃去生长液，加入含2%新生牛血清和3 mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，同时按5%（V/V）的接种量接种PCV2（DBN-SX07株）种毒，在37℃下继续培养72 h后收获。

2.2.4 异步接毒D组选取生长良好培养48 h的PK15细胞2瓶，弃去生长液，加入含2%新生牛血清和3 mmol/L的D-氨基葡萄糖盐酸的MEM细胞维持液，同时按5%（V/V）的接种量接种PCV2（DBN-SX07株）种毒，在37℃下继续培养72 h后收获。

2.3 病毒液的处理将A、B、C、D组收获的病毒液交替放置于-15℃和室温下，反复冻融3次，冻结保存、备用。

2.4 病毒含量检测使用消化后分散均匀的PK15细胞液适当比例稀释后，将每组病毒液作10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7三个稀释度接种于96孔培养板，每个稀释度6孔，100 μL/孔，同时设立阴性对照。置37℃含5%CO2培养箱中培养72 h。采用IFA法统计病毒感染孔数，根据Reed-Muench法计算病毒TCID50/mL。

3 结果

按照上述试验方法与步骤进行接毒培养试验并重复3次，收获病毒液的病毒含量检测结果见表1。试验结果表明，同步接毒A组和B组的病毒含量高于异步接毒C组和D组的病毒含量。同步接毒A组的病毒含量高于B组，异步接毒C组与D组的病毒含量没有明显差异。

4 讨论

1）关于PCV2在体外细胞培养的有些研究表明，PCV2在体外细胞培养时，不会导致细胞病变，病毒在细胞的增殖能力较差，主要原因可能是PCV2病毒的复制过程要依赖细胞聚合酶，这种酶主要在细胞繁殖S周期中合成，缩短了病毒的增殖期[3]。PK15细胞为增殖旺盛的细胞，第2～4 d为明显的指数生长期，生产曲线为较典型的“S”型，群体倍增时间为21.08 h[4]。本试验在PK15细胞上采用同步接毒法培养的PCV2病毒含量明显高于异步接毒法，是否可以说明同步接毒使PCV2病毒在细胞增殖过程的S期（合成期）,充分利用了所需的细胞聚合酶，从而提高病毒的复制数量，有待进一步探讨。

表1 不同接毒方法收获病毒液的病毒含量

2）在本试验过程中采用了D-氨基葡萄糖处理细胞，用此方法的目的是增强病毒的增殖能力。早期国外Tischer等[5]在对PCV1细胞培养特征研究中发现，D-氨基葡萄糖处理可显著增强病毒的增殖能力，这种生化试剂可能提高细胞S期合成的聚合酶量或延长聚合酶合成时间，但其作用机制尚未阐明。

3）从本试验的结果看，PCV2病毒在PK15细胞上的增殖能力与接毒的方法有很大关系。同步接毒法的病毒含量明显高于异步接毒法，并且采用在细胞悬液中同步一次性接入种毒的方法，病毒的增殖量最高。

[1]王一平,郭龙军,唐青海,等.猪圆环病毒2型疫苗的研究进展[J].畜牧兽医学报,2012,43(9):1337-1345.

[2]李红园,魏丽娟,魏占勇,等.猪圆环病毒2型研究进展[J].现代畜牧兽医,2014(11):56-60.

[3]刘长明,张超范,危艳武,等.猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定[J].中国预防兽医学报,2006,28(3):248-252.

[4]魏园园,马忠仁,王家敏,等.PK15细胞的生物学特性和质量评价研究[J].黑龙江农业科学,2015(5):61-65.

[5]Tischer I,Peters D,Rasch R,et al.Replication of porcine circovirus:Induction by glucosamine and cell cycle dependence[J].Arch Virol,1987,96:39-57.

Study on replication effect of porcine circovirus 2 by difference inoculation

Chen Yuwen
(Fuzhou Dabeinong Biotechnology Co.Ltd.,Fuzhou 350014)

The experiment containing synchronous inoculation(A group,B group)and asynchronous inoculation(C group,D group)was designed.A group was that PCV2 of 5%volume concentration was inoculated instantly after digesting PK-15 cells.B group is that firstly,PCV2 of 3%volume concentration was inoculated instantly after digesting cells and then 2%PCV2 was inoculated after 24 h culturing cells.Respectively,C group and D group represented that 5%PCV2 was inoculated after 24 h culturing cells and after 48 h culturing cells.Cells of all groups were harvested after 72 h and then PCV2 levels were detected by immunofluorescence method.The results showed that from A group to D group,PCV2 content was 107.0～7.25TCID50/mL,106.75～7.0TCID50/mL,106.4～6.5TCID50/mL and 106.25～6.5TCID50/mL,respectively.Overall,PCV2 levels of synchronous inoculation were better than asynchronous inoculation and effect of inoculating 5%PCV2 once instantly after digesting PK-15 cells was the best.

Porcine circovirus 2 Synchronous inoculation Asynchronous inoculation Virus content

A

1003-4331（2017）04-0021-02