陈丽萍 江兴华福州大北农生物技术有限公司福州350014

禽流感疫苗抗原浓缩工艺的研究

陈丽萍 江兴华福州大北农生物技术有限公司福州350014

为了提升禽流感疫苗中的抗原效价，本研究采用密理博公司的切向流超滤系统，选用不同孔径的超滤膜和浓缩倍数对禽流感病毒（H9N2亚型，HP株）进行浓缩，观察HA和EID50的变化。结果显示：膜包孔径越大，病毒透过越多，但膜包孔径过小，浓缩时间长；随着浓缩倍数增加，HA和EID50均呈正相关增长，但高浓缩倍数耗时较长。说明禽流感疫苗生产中应根据抗原相对分子质量、HA、EID50和生产效率选择合适的超滤膜孔径和浓缩倍数。

抗原浓缩禽流感病毒疫苗病毒含量

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科、A型流感病毒属的禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起家禽、野鸟和部分哺乳动物发病的一种传染病。由于AIV血清型众多，不同毒株间毒力差异很大，给临床诊断和防控带来很大的问题[1]。H9N2亚型AIV最早于1966年从火鸡体内分离到[2]，1997年以后H9N2亚型AIV在中国大陆的鸡和其他家禽甚至猪群中被分离到[3]，证实了中等毒力以下H9亚型AI在我国普遍存在，是影响我国养禽业的主要AIV亚型，且对禽的危害越来越严重，虽然表现低致病性，但由于传播广泛能造成免疫抑制并使宿主容易发生继发感染，特别是可导致鸡群产蛋下降或完全停止[2]，对养禽业造成巨大经济损失，其危害不容忽视。目前，对AI并没有有效的治疗措施，控制AI的有效手段是进行疫苗免疫接种，常规的免疫剂量内不能容纳足够的多种抗原，影响其免疫效力；要使免疫动物获得足量的AIV（H9N2亚型，HP株）抗原，就必须加大注射剂量，从而影响疫苗的应用[4]。疫苗的效果与其抗原量成正相关，要想获得较高的免疫保护率，足够的抗原量必不可少。提高单位体积的抗原含量是生产AIV（H9N2亚型，HP株）疫苗的关键，而通过浓缩来提高AIV（H9N2亚型，HP株）含量是理想的办法[5]。AIV（H9N2亚型，HP株）浓缩倍数的多少直接关系到抗原病毒含量和生产成本。所以，对不同浓缩倍数的参数进行摸索，对生产可以起到事半功倍的效果。

本研究主要是用密理博公司的切向流浓缩系统，开展两项试验。第一，使用30 K、100 K、300 K再生纤维素超滤膜，对3批抗原进行浓缩，摸索膜包孔径对浓缩效果的影响，以确定适合的膜包孔径；第二，用密理博公司的切向流浓缩系统，使用100 K再生纤维素超滤膜，通过对不同病毒含量的AIV（H9N2亚型，HP株）抗原分别进行2倍、3倍、4倍、5倍浓缩，对比其浓缩前与浓缩后的病毒含量、病毒损失情况及不同浓缩倍数的浓缩效率，从而为产业化生产提供浓缩工艺参数，提高浓缩工作效率、产品病毒含量，从而提高产品免疫效果。

1 材料

1.1 种毒原始种毒，来自河南农业大学禽病研究中心；生产用种毒，本公司自传。

1.2 种蛋非免蛋，购自扬州康威；SPF蛋，购自梅里亚维通公司。

1.3 设备高速管式离心机，购自上海浦东天本离心机械有限公司；切向流超滤系统，购自密理博公司；30 K、100 K、300 K再生纤维素超滤膜，购自密理博公司。

2 方法

2.1 抗原制备将AIV（H9N2亚型，HP株）种毒作适当倍数稀释，然后尿囊腔内接种发育良好的10日龄SPF鸡胚，每胚0.2 mL，置37℃继续孵育，接种后24 h照蛋一次，将在24 h前死亡的鸡胚弃去。24 h后，每4～8 h照蛋一次，死亡的鸡胚随时取出，直至96 h，不论死亡与否全部取出，置2～8℃冷却，然后收获鸡胚胚液装于灭菌容器内，置-15℃保存备用。

2.2 抗原离心将抗原提前取出置常温解冻，待完全解冻后，将抗原倒入罐体内，连接高速连续离心机对抗原进行离心，离心后的抗原接至罐体内，备用。

2.3 抗原浓缩

1）将3批离心过的病毒含量均为108.37EID50/ 0.1 mL的AIV（H9N2亚型，HP株）抗原用切向流超滤系统进行浓缩，分别选用30 K、100 K、300 K再生纤维素超滤膜，浓缩3倍后分别取样、待检。

2）将5批离心过的AIV（H9N2亚型，HP株）抗原在切向流超滤系统进行浓缩，选用100 K再生纤维素膜，在浓缩到2倍、3倍、4倍、5倍时分别取样、待检。

2.4 血凝价HA测定用微量移液器向96孔板每孔加入生理盐水25 uL，用移液器取病毒液样品25 uL加入第一孔内，吸头浸于液体中洗吹几次混匀后，再吸取25 uL至第2孔，如此连续稀释至第15孔，15孔吸取25 uL液体弃去；病毒稀释倍数依次为1:2～1:215，第16孔为红细胞对照。再用移液器每孔加1%鸡红细胞悬浮液25 uL，振荡器上振荡混匀，再置常温作用15～20 min，读取结果。

2.5 病毒含量EID50测定[6]将病毒液样品分别用灭菌生理盐水进行10倍系列稀释，取10-7、10-8、10-9三个稀释度的病毒液，分别尿囊腔内接种5枚10日龄发育良好的SPF鸡胚，每胚接种0.1 mL，接种后置37℃温室孵育至120 h。弃去72 h前死亡的鸡胚不计，随时取出72～120 h死亡的鸡胚，收获鸡胚胚液，将10-7、10-8、10-9三个滴度的鸡胚液分别测定红细胞凝集价，通过公式计算出病毒含量。

3 结果

3.1 用不同孔径膜包浓缩AIV（H9N2亚型，HP株）抗原取3批离心后的抗原，浓缩前病毒含量均为108.37EID50/0.1 mL，分别用30 K、100 K、300 K再生纤维素超滤膜进行浓缩，记录浓缩用时，浓缩后分别取样检测病毒含量。结果显示膜包孔径越大，浓缩用时越短，说明孔径大，浓缩速度快；不同孔径膜包浓缩后血凝价、病毒含量并没有太大差别；膜包孔径为30 K和100 K时，从废液HA和废液病毒增殖上看，废液病毒没有流失；膜包孔径为300 K时，废液HA为3log2，但废液病毒增殖并未发现感染，说明病毒流失不多（见表1）。

3.2 禽流感病毒（H9N2亚型，HP株）抗原浓缩用时用100 K膜包对5批AI抗原进行2倍、3倍、4倍、5倍浓缩，浓缩过程记录下浓缩所用时间，结果显示浓缩倍数越大，浓缩用时越长。结果见表2。

表2 禽流感病毒（H9N2亚型，HP株）抗原浓缩不同浓缩倍数的用时

3.3 不同浓缩倍数样品禽流感病毒（H9N2亚型，HP株）抗原HA测定对6批AI抗原进行2倍、3倍、4倍、5倍浓缩，对每批抗原浓缩后的样品测定HA，结果显示浓缩后HA呈正相增长，但与浓缩倍数不是呈线型关系；废液HA均为0，说明没有病毒透过至废液中。结果见表3。

3.4 不同浓缩倍数样品禽流感病毒（H9N2亚型，HP株）抗原病毒含量EID50的测定对6批抗原进行2倍、3倍、4倍、5倍浓缩，取样测其病毒含量。结果显示浓缩后EID50呈正相增长，废液病毒增殖没有发现感染。在浓缩2倍、3倍、4倍时EID50增长与理论值较为接近，但5倍浓缩时增长不多。结果见表4。

表1 不同孔径膜包浓缩禽流感病毒（H9N2亚型，HP株）抗原结果对比

表3 不同浓缩倍数样品禽流感病毒抗原HA的变化情况

表4 不同浓缩倍数样品禽流感病毒抗原EID50的变化情况

4 结论与讨论

1）该研究采用的切向流超滤浓缩技术可有效地用于AIV尿囊液的浓缩，同时选择的超滤浓缩系统具有浓缩快速和样品处理量大等特点，可1 h处理近百升的抗原液，适合于规模化生产。本试验可为其他病毒尿囊液或细胞培养液的浓缩提供参考。

2）在用300 K膜包浓缩过程中，病毒废液HA为3log2，但浓缩废液病毒增殖并没有感染，浓缩后病毒含量并没有明显差别，说明浓缩过程有少量病毒透过，但对总体病毒含量影响不大。用30 K、 100 K膜包浓缩病毒HA均为0，浓缩废液病毒增殖也没有感染，30 K膜包浓缩后病毒含量相对较100 K、300 K高，但是浓缩时间比较长，效率较低，所以，100 K膜包更适合规模化生产。

3）在病毒液浓缩过程中，病毒液的效价并没有按照浓缩体积的倍数递增，表明在浓缩过程中还会有部分病毒损失。AIV粒子直径80～120 nm[7]，膜包孔径为100 K、300 K，在浓缩过程中病毒有少部分透过，可能在浓缩过程中的剪切力对病毒也有一定损伤。在高浓缩倍数时，浓缩后HA和EID50均增长不多，且浓缩时间也比较长，效价损失较大，加上高浓缩倍数的生产成本也高，所以，在生产中不建议高浓缩倍数。

综合考虑，生产中可以选用100 K膜包、2～3倍浓缩AIV来提高抗原病毒含量，另一方面应在生产抗原时改进抗原生产工艺来提升抗原效价，提升产品质量。

[1]孙泉云,陈琦,夏炉明.H9N2亚型禽流感流行现状[J].动物医学进展,2011,32(10):107-111.

[2]高彦生.香港发生人的H9N2禽流感[J].动物科学与动物医学,2004,21(10):26.

[3]陆海融,樊晓晖.禽流感病毒H9N2亚型的研究进展[J].广西医学,2005,27(5):699-701.

[4]阮武营,崔保安,李新生,等.新城疫病毒-减蛋综合征病毒抗原液与抗原浓缩液的HA效价关系[J].中国畜牧兽医, 2010,37(1):180-181.

[5]姜北宇,刘月焕,景小冬,等.禽用疫苗病毒浓缩技术的研究[J].华北农学报,2007,22(5):165-171.

[6]江兴华.鸡新城疫(La Sota株)活疫苗生产中不同时间段死亡鸡胚胚液效价的研究[J].福建畜牧兽医,2006,28(6):34.

[7]鲁健,田科雄.H9N2禽流感病毒研究进展[J].实用预防医学,2011,18(2):383-385.

福建省畜牧兽医学会工作动态

根据《福建省畜牧兽医学会章程》的相关规定，福建省畜牧兽医学会第十二次会员代表大会拟于2017年9月下旬在福州举行。会议将听取并审议学会第十一届理事会工作报告，审议《福建省畜牧兽医学会章程（修改草案）》，选举产生福建省畜牧兽医学会第十二届理事会，并进行表彰奖励。为确保大会顺利召开，现正进行大会代表和理事候选人选举推荐工作，可关注不断完善中的福建省畜牧业协会、福建省畜牧兽医学会官网《福建畜牧网》(www.fjxmw.org.cn)。

为表彰在开展学术交流、科技咨询、技术培训、科学普及等方面做出贡献的学会会员，根据《福建省畜牧兽医学会章程》及《福建省畜牧兽医学会理事管理制度》的相关规定，福建省畜牧兽医学会决定对2016-2017年度推广畜牧兽医科技先进集体和学会工作先进个人进行表彰。评选结果将在《福建畜牧网》、《福建畜牧兽医》杂志等相关媒体上公示。获奖的先进集体将授予牌匾、颁发证书，获奖的先进个人将颁发荣誉证书，并予以适当奖励。

（本刊讯）

Study on the concentration skills of antigen of avian influenza vaccines

Chen Liping Jiang Xinghua
（Fuzhou Dabeinong Biotechnology Co.Ltd.,Fuzhou 350014）

In order to increase antigen levels of avian influenza vaccines,avian influenza viruses（H9N2 subtype,HP strain）were concentrated with difference pore diameter uLtrafiltration membrane and difference concentration times by tangential flow filtration systems of Merck Millipore.And the HA and EID50of avian influenza viruses concentrated were examined to compare and analyze.The resuLts showed that more avian influenza viruses were wasting with increasing of pore diameter of uLtrafiltration membrane,but it took more time with decreasing of pore diameter.Also,HA and EID50increased depending on concentration times,and it took more time with increasing of concentration times.Overall,it shouLd synthetically consider relative molecuLar mass of antigen,HA,EID50and production efficiency to choose appropriate pore diameter uLtrafiltration membrane and concentration times in production of avian influenza vaccines.

Antigen concentration Avian influenza virus Vaccine Virus content

A

1003-4331（2017）04-0005-03