项冰倩， 高 慧， 楼国强， 郝卯林， 王万铁

(温州医科大学缺血/再灌注损伤研究所， 浙江 温州 325035)

右美托咪定通过抑制内质网应激反应减轻肺缺血/再灌注小鼠肾损伤*

项冰倩， 高 慧， 楼国强， 郝卯林△， 王万铁△

(温州医科大学缺血/再灌注损伤研究所， 浙江 温州 325035)

目的： 评价右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)通过抑制内质网应激反应减轻小鼠肺缺血/再灌注(I/R)诱发肾损伤的机制。方法: 雄性健康SPF级C57BL/6J小鼠50只，体重20～24 g， 8～10周龄，随机分为5组(n=10)：假手术组(sham组)、I/R组、阿替美唑(atipamezole，Atip)组、DEX组和DEX+Atip组。采用小鼠在体左侧肺门夹闭30 min再灌注180 min方法制备肺缺血/再灌注损伤(I/R)模型。Atip组、DEX组和DEX+Atip组分别在肺门阻断前30 min腹腔注射Atip(250 μg/kg)、DEX(20 μg/kg)和DEX+Atip，其余处理同I/R组。再灌注结束后眼眶采血检测血肌酐与尿素氮浓度，取肾组织光镜下观察肾细胞的形态学改变，检测caspase-3的酶活性，TUNEL法检测肾细胞凋亡指数，Western blot和RT-PCR检测c-Jun氨基末端激酶(JNK)、caspase-12、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的蛋白及mRNA水平。结果: 与假手术组相比，其余组光镜下肾组织有明显损伤，血肌酐与尿素氮、肾细胞凋亡指数、caspase-3酶活性、JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的蛋白及mRNA水平均升高(P<0.01)。与I/R、Atip组和DEX+Atip组相比，DEX组光镜下可见肾细胞损伤减轻，血肌酐与尿素氮、肾细胞凋亡指数、caspase-3酶活性、JNK、caspase-12和CHOP表达均有下降，GRP78表达升高，差异有统计学意义(P<0.01)。结论: 右美托咪定预先给药可减轻小鼠肺缺血/再灌注诱发的肾损伤，其机制可能与激动α2-肾上腺素能受体，抑制内质网过度应激有关。

右美托咪定； 缺血/再灌注损伤； 内质网应激； 细胞凋亡

肺缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤是围手术期常见并发症之一，多见于肺溶栓治疗、肺移植、心肺联合移植等手术治疗。肺缺血/再灌注损伤常引发急性肺损伤，同时也伴随远隔器官的功能障碍和病理性损伤，如心脏、肝脏及肾脏等。肾脏毛细血管丰富，对肺I/R反应中的促炎因子较为敏感，使之容易发生急性肾损伤(acute kidney injury，AKI), 当肺I/R合并肾脏损伤时，可明显增加死亡率。肺缺血再灌注引起的缺血、缺氧可诱发内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，适度的ERS可恢复细胞内环境稳态和维持细胞存活，但过度的ERS则会加重组织损伤。研究表明，内质网应激在缺血再灌注损伤中有重要作用，可诱发细胞凋亡[1-2]。

右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是高选择性α2-肾上腺素能受体激动药，我们前期的研究结果表明，肺脏缺血前给予右美托咪定可降低促炎介质和炎性因子，从而减轻肺的缺血/再灌注损伤，具有肺脏保护作用[3]。同时有研究证明右美托咪定对I/R损伤的心脏、脑、肝脏、肠等也具有一定的保护作用[4-8]。但右美托咪定对肺缺血/再灌注致远隔肾损伤的影响仍有待探讨。本实验旨在研究右美托咪定能否通过抑制内质网应激来减轻小鼠肺缺血/再灌注诱发肾损伤，为临床防治肺I/R引起的远隔器官损伤提供新治疗思路与方法。

材 料 和 方 法

1 动物

雄性健康SPF级C57BL/6J小鼠50只，体重20～24 g， 8～10周龄，由温州医科大学实验动物中心提供,合格证编号为SYXK(浙)2012-075。

2 主要试剂

氯胺酮(福建古田药业有限公司)；塞拉嗪(吉林长春华牧有限公司)；阿替美唑(atipamezole，Atip)和DEX(江苏恒瑞制药有限公司)；BCA试剂盒和caspase-3活性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；TUNEL凋亡试剂盒(Roche)；本实验中所用I抗均购自Cell Signaling Technology， II 抗均购自杭州至贤生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 实验分组 实验动物按随机数字表法分为5组(n=10)：假手术组(sham组)、肺缺血/再灌注损伤组(I/R组)、肺缺血/再灌注+阿替美唑组(Atip组)、肺缺血/再灌注+右美托咪定组(DEX组)和肺缺血/再灌注+右美托咪定+阿替美唑(DEX+Atip组)。

3.2 肺缺血/再灌注模型的制备 依据文献采用C57BL/6J小鼠在体左侧肺门夹闭制备I/R模型[9]。100 mg/kg氯胺酮+10 mg/kg塞拉嗪联合腹腔注射进行麻醉，消毒胸颈部皮肤后切开并分离皮下组织和肌肉，暴露气管行T型切开，气管插管后接呼吸机行机械通气,呼吸机参数为吸呼比 2∶3、呼吸频率120次/分、100%氧浓度、潮气量0.6～0.8 mL/min。于左胸部3～5肋间处开胸并游离左侧肺门，动脉夹阻断左肺门，30 min后恢复血流再灌注180 min。灌注结束后处死小鼠并取肾组织。Sham组小鼠仅开胸不夹闭肺门，机械通气210 min； I/R组小鼠左肺门阻断30 min，再灌注180 min； Atip组、DEX组和DEX+Atip组小鼠分别在肺门阻断前30 min腹腔注射阿替美唑(250 μg/kg)、右美托咪定(20 μg/kg)和右美托咪定+阿替美唑，其余处理同I/R组。

3.3 光镜下肾组织的形态学观察 取出肾组织后，取约0.5 cm3大小肾组织，经4%多聚甲醛固定数天后石蜡包埋切片，HE染色后光镜下观察各组标本组织学改变 。

3.4 血清肌酐及尿素氮浓度的检测 实验结束后取血液，离心后取血清，用COBAS全自动生化分析仪测定血清肌酐值和尿素氮值。

3.5 TUNEL 法检测肾细胞凋亡指数 取血结束后处死小鼠，分离出肾脏并用无菌PBS漂洗，经4%多聚甲醛固定，依次经脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、烘烤固定制成肾组织切片，再依次经二甲苯、无水乙醇、95%、90%、85%、80%和75%乙醇脱水、PBS漂洗后加入蛋白酶K溶液去除组织蛋白，蒸馏水漂洗。按TUNEL试剂盒说明书进行操作，光学显微镜(×400)下观察肾细胞凋亡情况。细胞核呈现棕黄色为凋亡细胞。每张切片随机选择10个视野并记录总细胞数和凋亡细胞数，计算凋亡指数(%)=凋亡细胞数÷总细胞数×100%。

3.6 Caspase-3酶活性的检测 按每3～10 mg肾组织加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，冰上研磨成匀浆，转移到1.5 mL离心管中冰上裂解5 min。4 ℃、20 000 r/min离心10～15 min后转移上清液，按照caspase-3活性检测试剂盒操作说明书进行操作，采用分光光度计法检测肾组织中caspase-3酶活性。

3.7 RT-PCR检测肾组织c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、葡萄糖调节蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)、caspase-12和CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)的mRNA表达水平 取小鼠肾组织加液氮冰上研磨，以Trizol法提取总RNA并测定RNA浓度，按照RT-PCR试剂盒(Thermo)说明书进行cDNA合成及扩增。PCR参数: 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ (JNK)、58 ℃ (caspase-12)、54 ℃ (CHOP)、49 ℃ (GRP78) 或58 ℃ (GAPDH) 30 s, 72 ℃ 1 min, 循环33次; 72 ℃ 5 min。RT-PCR以GAPDH为内参照。引物序列见表1。结果用Quantity One分析。以目的基因条带灰度值和内参照GAPDH条带灰度值的比值反映其表达水平。

表1 PCR引物序列

3.8 Western blot 检测肾组织p-JNK、 GRP78、caspase-12和CHOP的蛋白水平 冰上研磨肾组织，加入400 μL RIPA冰中裂解组织20 min，吸取匀浆液4 ℃离心取上清，BCA蛋白定量试剂盒测蛋白浓度并绘标准曲线，随后100 ℃煮沸10 min使蛋白变性。配胶进行电泳、转膜，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，TBST漂洗后分别加 I 抗(p-JNK、JNK和GRP78 均以1∶1 000稀释；GAPDH和caspase-12以1∶500稀释，CHOP以1∶300稀释)4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次后加 II抗室温孵育1 h，再次TBST洗涤，加ECL工作液反应3 min，暗室曝光，Quantity One软件分析蛋白吸光度值。取目的蛋白条带吸光度值和内参照条带吸光度值的比值。计算p-JNK与JNK的比值，以反映p-JNK蛋白的水平。

4 统计学处理

使用SPSS 19.0软件分析，计量资料行正态性检验，实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示。组间比较采用单因素方差分析，多组样本的均数比较先行方差齐性检验，方差齐者，两两比较行SNK-q检验，方差不齐者行Duunet’s检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 光镜下各肾组织形态学变化

光镜下sham组肾小球和肾小管结构清晰可见，未见明显异常。I/R组、Atip组和DEX+Atip组的肾小球轮廓基本清楚，肾小管排列较为疏松、紊乱，上皮细胞明显肿胀，部分出现空泡变性，部分肾小管管腔扩张，间质水肿。DEX组的肾组织损伤减轻，肾小球和肾小管轮廓清晰，上皮细胞水肿程度减轻。见图1。

Figure 1.The histological changes of renal tissues in each group (HE staining, ×200).

图1 光镜下各组肾组织形态学变化

2 各组血肌酐及尿素氮浓度变化

与sham组相比，其余4组的血清肌酐及尿素氮均有升高(P<0.01)；与I/R组相比，Atip组和DEX+Atip组无明显差异，DEX组血肌酐及尿素氮均有下降(P<0.01)。与Atip组比较，DEX组明显下降(P<0.01)，而DEX+Atip组的差异无统计学显著性；与DEX组相比，DEX+Atip组的血肌酐及尿素氮水平升高(P<0.01)，见表2。

表2 各组血肌酐、尿素氮浓度、肾组织caspase-3酶活性及肾细胞凋亡指数的变化

Table 2.The changes of serum creatinine (SCr)， blood urea nitrogen (BUN), renal caspase-3 enzymatic activity and apoptotic index of renal cells (Mean±SD.n=10)

GroupSCr(μmol/L)BUN(mmol/L)Caspase-3enzymaticactivityApoptoticindexofrenalcells(%)Sham22.4±3.47.6±2.039.8±5.57.9±2.5I/R39.8±2.1**19.0±2.2**104.1±8.0**58.9±3.7**Atip39.3±1.919.2±2.6105.5±7.958.5±4.6DEX28.8±2.3##△△13.4±1.8##△△81.7±4.1##△△40.5±3.8##△△DEX+Atip39.1±2.5▲▲19.2±2.4▲▲108.9±8.8▲▲61.1±3.3▲▲

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

3 各组肾细胞凋亡指数的变化

与sham组相比，其余4组的肾细胞凋亡率均有升高(P<0.01)；与I/R组相比，Atip组和DEX+Atip组差异无统计学显著性，DEX组的肾细胞凋亡指数下降(P<0.01)。与Atip组比较，DEX组的肾细胞凋亡指数明显下降(P<0.01)，而DEX+Atip组的差异无统计学显著性；与DEX组相比，DEX+Atip组的肾细胞凋亡指数升高(P<0.01)，见图2、表2。

Figure 2.The apoptosis of the renal cells in each group detected by TUNEL (×400)

图2 TUNEL法检测各组肾细胞凋亡情况

4 各组肾组织caspase-3酶活性的变化

与sham组相比，其余4组的caspase-3酶活性均有升高(P<0.01)； Atip组和DEX+Atip组与I/R组相比差异无统计学显著性，DEX组的caspase-3酶活性与I/R组相比显著下降(P<0.01)。与Atip组比较，DEX组的caspase-3酶活性明显下降(P<0.01)，DEX+Atip组与Atip组比较差异无统计学显著性；与DEX组相比，DEX+Atip组的caspase-3酶活性升高(P<0.01)，见表2。

5 各肾组织p-JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的蛋白水平

与Sham 相比，其余各组p-JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的蛋白水平均明显升高(P<0.01)； Atip组和DEX+Atip组与I/R组相比差异无统计学显著性，DEX组的p-JNK、caspase-12和CHOP蛋白水平下降(P<0.01)，GRP78蛋白水平升高(P<0.01)。与Atip组比较，DEX组的p-JNK、caspase-12和CHOP蛋白水平明显下降(P<0.01)，GRP78蛋白水平升高(P<0.01)，DEX+Atip组与Atip组比较差异无统计学显著性；与DEX组相比，DEX+Atip组的p-JNK、caspase-12和CHOP蛋白水平升高(P<0.01)，但GRP78蛋白水平无显著改变，见图3～6。

Figure 3.The protein level of p-JNK in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

图3 各组p-JNK蛋白水平的比较

Figure 4.The protein expression level of caspase-12 in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

图4 各组caspase-12蛋白表达量的变化

Figure 5.The protein expression level of CHOP in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

图5 各组CHOP蛋白表达量的变化

Figure 6.The protein expression of GRP78 in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group.

图6 各组GRP78蛋白表达量的变化

6 各肾组织JNK、caspase-12、CHOP和GRP78 mRNA表达水平

与sham相比，其余各组JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的mRNA水平均明显升高(P<0.01)； Atip组和DEX+Atip组与I/R组相比的差异无统计学显著性，DEX组JNK、caspase-12和CHOP的mRNA水平下降(P<0.01)，GRP78的mRNA水平升高(P<0.01)。与Atip组比较，DEX组的JNK、caspase-12和CHOP的mRNA水平明显下降(P<0.01)，GRP78的mRNA水平升高(P<0.01)，DEX+Atip组与Atip组比较差异无统计学显著性；与DEX组相比，DEX+Atip组JNK、caspase-12和CHOP的mRNA水平升高(P<0.01)，GRP78的mRNA水平无变化,见图7～10。

Figure 7.The mRNA expression level of JNK in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

图7 各组JNK的mRNA表达水平

Figure 8.The mRNA expression level of caspase-12 in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

图8 各组caspase-12的mRNA表达水平

Figure 9.The mRNA expression level of CHOP in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

图9 各组CHOP的mRNA表达水平

Figure 10.The mRNA expression level of GRP78 in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group.

图10 各组GRP78的mRNA表达水平

讨 论

右美托咪定为高选择性α2-肾上腺素能受体激动药，能够激活胆碱能抗炎通路，具有抗炎、器官保护作用[10]；作用于中枢神经系统的α2-肾上腺素能受体时，可使细胞产生超极化，进而抑制神经元的放电，阻断了疼痛信号向大脑传导，产生镇静、镇痛、抗焦虑和抑制交感活动、间接提高迷走神经张力的效应，其它作用还包括抗寒战、止涎和利尿等[11-12]。常用于血管疾病患者围手术期的辅助麻醉与镇静镇痛，有很好的围术期器官保护作用，能有效改善术中缺血对器官的损伤[13]。

器官缺血/再灌注时细胞内信号转导涉及多条途径, 其中内质网应激和JNK信号转导通路在脏器I/R中起重要作用[1]。ATP耗竭、缺血缺氧、氧化应激、葡萄糖/营养物质匮乏等均可引起ERS, 适度的ERS对机体起保护作用，但持续过强ERS将导致细胞凋亡[14-15]。本实验检测的4种蛋白JNK、caspas-12、CHOP和GRP78为内质网应激相关蛋白。其中GRP78是一种位于内质网内的钙离子结合分子伴侣，当细胞受到外界刺激发生ERS时，细胞内会产生大量错误折叠或未折叠蛋白蓄积，此时GRP78也会大量表达从而与ER中错误折叠和未折叠蛋白结合，维持内环境稳定。因此，GRP78的急速上调被认为是ERS 最敏感的标志物[16-17]。JNK信号转导通路是MAPKs信号通路中重要的通路之一，与应激诱导型凋亡有关，可被多种细胞外应激激活而引起细胞凋亡。有研究表明，在脏器I/R损伤过程中JNK发生过度激活，而在缺血或再灌注前抑制JNK激活可明显减少细胞凋亡，减轻脏器I/R损伤[18-20]。Caspase-12广泛存在于小鼠的各组织中，是ERS的主要凋亡信号分子之一，内质网内钙离子平衡的失调或者内质网蛋白积累过多都会导致caspase-12的表达，最终导致细胞凋亡的发生[21-22]。CHOP又称生长停滞及DNA损伤诱导蛋白153(growth arrest and DNA damage-inducible protein 153，GADD153)，是一个特异性的内质网应激转导因子，是促凋亡的重要信号分子，在正常情况下表达水平很低，而在ERS时，其表达量大大增加，被认为是内质网应激的标志物[23-24]。细胞凋亡通过线粒体途径被激活，释放线粒体促凋亡蛋白及凋亡诱导因子(apoptosis-inducing factor，AIF)等，激活caspase级联反应，诱发细胞凋亡，表现为caspase-3凋亡蛋白酶活性升高。

研究结果显示，与假手术组相比，其余4组JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的mRNA及蛋白、caspase-3凋亡蛋白酶、血肌酐和尿素氮以及肾细胞凋亡指数均呈上升趋势，光镜下肾小管有不同程度的水肿，肾细胞均有损伤性的变化，说明肺I/R的确引发肾组织发生过度ERS反应，使ERS相关蛋白表达上升，并通过线粒体途径诱发细胞凋亡引起肾组织的损伤；I/R组和Atip组相比，以上检测指标均无明显差异，说明阿替美唑对肺I/R诱发的肾损伤没有拮抗作用。与I/R组相比，DEX组的JNK、caspase-12、CHOP水平、caspase-3凋亡蛋白酶活性、血肌酐和尿素氮以及肾细胞凋亡指数均有下降，光镜下肾细胞水肿和损伤性变化减轻，说明DEX可能通过抑制内质网过度应激反应降低JNK、caspase-12和CHOP的水平，同时使肾细胞凋亡数量减少，从而减轻肺I/R诱发的肾损伤，对肾组织起保护作用。而通过DEX组与DEX+Atip组比较，我们发现右美托咪定对肾组织的保护作用能被选择性α2-肾上腺素受体阻滞剂阿替美唑所阻断，表现为DA组的JNK、caspase-12、CHOP蛋白水平与caspase-3凋亡蛋白酶活性、血肌酐和尿素氮以及肾细胞凋亡指数均呈上升趋势，光镜下肾组织损伤加重，提示右美托咪定减轻肺I/R诱发的肾损伤的作用可能与激动α2-肾上腺素能受体有关。

综上所述，肺缺血/再灌注前给予右美托咪定可减轻肺缺血/再灌注诱发的肾损伤，其机制可能与其通过激动α2-肾上腺素能受体，抑制内质网过度应激有关。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Dexmedetomidine reduces renal injury induced by lung ischemia/reperfusion in mice through inhibiting endoplasmic reticulum stress response

XIANG Bing-qian, GAO Hui, LOU Guo-qiang, HAO Mao-lin, WANG Wan-tie

(Ischemia/ReperfusionInjuryResearchInstituteofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:wwt@wmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of dexmedetomidine (DEX) on renal injury induced by lung ischemia/reperfusion (I/R) in mice and its relationship with endoplasmic reticulum stress response. METHODS: Healthy SPF male C57BL/6J mice, weighing 20～24 g, aged 8～10 weeks, were randomly divided into 5 groups (n=10 each): sham operation group (sham group), I/R group, atipamezole (Atip) group, DEX group, and DEX+Atip group.Invivolung I/R model was established by occlusion of the left pulmonary artery for 30 min followed by 180 min of reperfusion in the mice. The Atip (250 μg/kg)， DEX (20 μg/kg) and DEX+Atip were intraperitoneally infused into the mice before left pulmonary hilus was blocked in Atip group, DEX group and DEX+Atip group, and other operations were the same as I/R group. After experiment， the mice were killed， and the renal tissues were harvested to observe the morphological changes. The enzymatic activity of caspase-3, serum creatinine and blood urea nitrogen, and cell apoptotic index of the renal cells were also analyzed. The expression of c-Jun N-terminal kinase (JNK), caspase-12， CCAAT/enhancer-binding protein homdogous protein (CHOP) and glucose-regulated protein 78 (GRP78) at mRNA and protein levels in the renal tissues was determined by RT-PCR and Western blot. RESULTS: Compared with sham group, the enzymatic activity of caspase-3, serum creatinine and blood urea nitrogen, renal cell apoptotic index, and the mRNA and protein levels of JNK, caspase-12, CHOP and GRP78 in I/R group were significantly increased (P<0.01), and the renal tissues had obvious damage under light microscope. Compared with I/R group, Atip group and DEX+Atip group, the enzymatic activity of caspase-3, serum creatinine and blood urea nitrogen, renal cell apoptotic index, and the mRNA and protein levels of JNK, caspase-12 and CHOP in DEX group were significantly decreased, and the expression level of GRP78 significantly increased (P<0.01). Furthermore, the renal tissue damage was obvious reduced. CONCLUSION: DEX effectively relieves the renal injury induced by lung I/R in mice, which may be associated with exciting α2-adrenergic receptor and inhibiting endoplasmic reticulum stress response.

Dexmedetomidine; Ischemia/reperfusion injury; Endoplasmic reticulum stress; Apoptosis

1000- 4718(2017)07- 1288- 07

2017- 02- 20

2017- 03- 21

浙江省公益技术应用研究项目(No. 2013C33168)；浙江省新苗人才计划项目(No. 2014R413043)；温州市公益性科技计划项目(No. Y20140652)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.022

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△通讯作者 Tel: 0577-86689817; E-mail： wwt@wmu.edu.cn