刘彦锋， 刘 展

(1 南阳医专一附院麻醉科， 2南阳市中心医院麻醉科一部， 河南 南阳 473000)

可乐定通过激活胆碱能抗炎通路抑制肺损伤小鼠炎性反应

刘彦锋1△， 刘 展2

(1南阳医专一附院麻醉科，2南阳市中心医院麻醉科一部， 河南 南阳 473000)

目的： 探讨可乐定对肺损伤小鼠炎性反应的影响及其作用机制。方法: 以脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)诱导的肺损伤小鼠为模型，静脉注射可乐定，取左肺上叶组织，检测肺湿干重比(W/D)和总肺含水量(TLW)，ELISA试剂盒检测炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，RT-PCR和Western blot检测α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)、高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达的变化；鼻内吸入法将α7nAChR基因RNA干扰慢病毒载体导入肺损伤模型小鼠肺内，或者静脉注射HMGB1外源性蛋白，检测炎性因子和HMGB1的变化。结果: 可乐定可减轻LPS诱导的小鼠肺损伤，并通过降低细胞因子IL-6、IL-10和TNF-α水平从而抑制LPS诱导的炎性反应；可乐定促进α7nAChR表达从而激活胆碱能抗炎通路，并抑制HMGB1的表达。结论: 可乐定对肺损伤小鼠具有抗炎作用，这可能与激活胆碱能抗炎通路，抑制HMGB1的表达有关。

可乐定； 肺损伤； 炎性反应； 胆碱能抗炎通路； α7烟碱型乙酰胆碱受体； 高迁移率族蛋白B1

可乐定(clonidine，CLO)是α2-肾上腺素受体激动剂，作为一种麻醉辅助用药已经在临床上广泛应用[1-2]。可乐定能够抑制中枢神经，具有降低血压、镇痛等作用。此外，近年动物实验研究发现，可乐定可以减轻低氧大鼠创伤后的炎症反应，表明可乐定具有抗炎作用。乙酰胆碱(acetyl choline，ACh)是一种分布广泛的重要神经递质。有研究表明可乐定通过抗胆碱能作用，抑制胃肠道的过量分泌及胃肠蠕动，从而促进肠黏膜对液体和电解质的吸收[3]。可乐定能够可逆性抑制乙酰胆碱的合成与释放以及乙酰胆碱受体[4]。

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)发病过程中，促炎细胞因子和抑炎细胞因子的共同作用介导着炎症的发生和发展。有研究报道，LPS可诱导ALI，并促进炎性因子的分泌[5]。细胞胆碱能抗炎通路是近年来发现的一种抗炎途径[6-7]，主要通过α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7nAChR)发挥抗炎作用[8-9]，α7nAChR对大鼠缺血再灌注后肺组织中炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的产生具有抑制作用[10-11]。高迁移率族蛋白B1(high-mobility group box protein 1，HMGB1)是一个含有215个氨基酸残基的单链多肽，近年来研究发现，HMGB1在关节炎、急性肺损伤、缺血再灌注损伤等急慢性疾病扮演了重要角色[12-13]。

本实验在建立小鼠肺损伤模型的基础上，通过检测可乐定对炎性反应以及α7nAChR和HMGB1表达的影响，明确其对肺损伤的作用，为可乐定的作用机制研究提供新思路。

材 料 和 方 法

1 材料

10～12周龄BALB/c清洁级小鼠，雌性，体质量(23±2) g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供。

可乐定、LPS和外源性HMGB1蛋白均购自Sigma；胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Gibco；RPMI-1640培养基购自杭州四季青；RT-PCR试剂盒及RT-PCR引物合成购自上海生工生物；抗体购自BioSystems；ELISA检测试剂盒购自武汉博士德。

2 方法

2.1 小鼠α7nAChR小干扰RNA慢病毒表达载体的构建 根据小鼠α7nAChR基因序列(GenBank NM_04127)设计合成小分子干扰序列(siRNA)并设计与α7nAChR干扰无关的序列(si-mock)作为阴性对照，两者经BLAST比对与小鼠其它基因无明显同源性。利用慢病毒载体试剂盒分别制备α7nAChRsiRNA(si-α7nAChR)和阴性对照慢病毒载体。

2.2 实验分组及模型建立 将小鼠随机分为6组，每组8只：空白对照组，腹腔注射等量生理盐水；LPS组，腹腔注射20 mg/kg LPS；LPS+CLO组，LPS注射15 min 前静脉缓慢推注可乐定30 μg/kg；LPS+CLO+HMGB1组，LPS+CLO注射15 min 前注射外源性HMGB1蛋白10 mg/L；LPS+CLO+ si-mock组和LPS+CLO+si-α7nAChR组，分别将α7nAChR基因小干扰RNA或阴性对照慢病毒载体以鼻内吸入法导入已注射可乐定的肺损伤模型小鼠肺内，病毒载体滴度为1×1011TU/L， 5 μL。

2.3 肺湿干重比(wet weight/dry weight ratio,W/D)和总肺含水量(total lung water content,TLW)检测 取左肺上叶组织，用生理盐水漂洗，滤纸吸干水分，称重为湿重(W)；在恒温电热鼓风干燥箱70 ℃ 24 h烘干后称重为干重(D)，两者之比为W/D。TLW的计算公式如下：TLW=(W-D)/D。右肺置于-80 ℃冰箱中冻存，用于RT-PCR和Western blot法检测。

2.4 ELISA检测炎性细胞因子的含量 取小鼠肺泡灌洗液，根据ELISA检测试剂盒说明书操作，分别测定IL-6、IL-10和TNF-α的含量。

2.5 RT-PCR检测mRNA的表达 Trizol提取总RNA，加入引物逆转录合成cDNA后进行DNA扩增。α7nAChR的上游引物序列为5′-CATTGACGTTCGCTGGTTCC-3′，下游引物序列为5′-ATGGTGCTGGCGAAGTATTG-3′；HMGB1的上游引物序列为5′-ATGGGCAAAGGAGATCCTA-3′，下游引物序列为5′-ATTCATCATCATCATCTTCT-3′；β-actin的上游引物序列为5’-ACTGCCGCATCCTCTTCCTC-3’，下游引物序列为5’-AAGCATTTGCGGTGCACGA-3’。PCR反应条件为： 94 ℃ 3 min； 94 ℃ 45 s， 58 ℃ 50 s， 72 ℃ 1 min，共35个循环； 72 ℃ 7 min。产物进行琼脂糖凝胶电泳，凝胶扫描成像。电泳图像用Quanity One软件进行灰度分析。

2.6 Western blot分析 提取组织总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度，总蛋白经SDS-PAGE分离，转膜，封闭1 h，再分别加入相应的 I 抗稀释液(兔抗小鼠α7nAChR和HMGB1多克隆抗体，1∶1 000)，4 ℃封闭过夜，洗膜后加入 II 抗(辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG，1∶500)孵育1 h，用ECL试剂盒进行显色反应，凝胶图像分析系统对电泳条带灰度扫描，以β-actin为内参照。

3 统计学处理

采用SPSS 11.5进行实验数据分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，单因素方差分析(one-way ANOVA)进行组间比较和统计分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 可乐定对肺损伤的抗炎作用

腹腔注射LPS建立急性肺损伤小鼠模型，提取肺组织，检测发现W/D和TLW均显著提高(P<0.05)，表明肺组织受到严重损伤，IL-6、IL-10和TNF-α的含量增加，且差异具有统计学显著性(P<0.05)；静脉推注可乐定后发现，W/D和TLW下降，IL-6、IL-10和TNF-α的含量也显著下调(P<0.05)，见图1。结果表明，可乐定具有减轻肺损伤，抑制炎性反应的能力。

Figure 1.The anti-inflammatory effect of clonidine on lung injury. A: detection of W/D and TLW; B: ELISA was used to detect the content of inflammatory factors. CLO: clonidine. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsLPS group.

图1 可乐定对肺损伤的抗炎作用

2 可乐定对肺损伤小鼠α7nAChR和HMGB1表达的影响

通过检测肺损伤小鼠肺组织中α7nAChR和HMGB1的mRNA和蛋白表达变化发现，LPS诱导肺损伤小鼠α7nAChR的表达受到抑制，而HMGB1则高表达(P<0.05)。静脉注射可乐定后，α7nAChR的表达有所增加，即激活了胆碱能抗炎通路，而HMGB1表达减少。由此可以推测，可乐定在肺损伤中的作用可能与上调α7nAChR、抑制HMGB1的表达有关，见图2。

Figure 2.The effect of clonidine on the expression of α7nAChR and HMGB1. The mRNA and protein levels of α7nAChR and HMGB1 were detected by RT-PCR (A) and Western blot (B), respectively. Mean±SD.n=6.*P<0.05vscontrol group；#P<0.05vsLPS group.

图2 可乐定对α7nAChR和HMGB1表达的影响

3 α7nAChR和HMGB1对炎性因子分泌的影响

上述结果显示可乐定的抗炎作用可能与α7nAChR和HMGB1的表达有关。向已注射可乐定的肺损伤小鼠肺内导入si-α7nAChR慢病毒载体抑制α7nAChR，结果发现炎性因子的分泌明显增加(P<0.05)。注射外源性的HMGB1蛋白，结果相似，炎性因子的含量也增加(P<0.05)，说明α7nAChR和HMGB1均参与了LPS诱导的肺损伤炎性反应，α7nAChR抑制IL-6、IL-10和TNF-α的生成，而HMGB1可促进炎性因子的释放，见图3。

4 可乐定通过α7nAChR调控HMGB1的表达

我们猜测α7nAChR与HMGB1之间可能存在调控关系，通过RNA干扰的方法下调α7nAChR的表达，结果发现导入si-α7nAChR后，α7nAChR的蛋白表达水平显著下降(P<0.05)，提示si-α7nAChR能够有效沉默α7nAChR的表达。进而检测si-α7nAChR对HMGB1 mRNA和蛋白表达水平的影响，结果如图4所示，si-α7nAChR明显上调HMGB1的mRNA及蛋白表达水平，差异具有统计学显著性(P<0.05)。由此可以推测可乐定是通过α7nAChR负调控HMGB1的表达。

Figure 3.The effects of α7nAChR and HMGB1 on the production of cytokines. The levels of IL-6, IL-10 and TNF-α were determined by ELISA. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLPS+CLO group；#P<0.05vsLPS+CLO+si-mock group.

图3 α7nAChR和HMGB1对炎症因子分泌的影响

Figure 4.Down-regulation ofα7nAChRon the expression of HMGB1. The silencing efficiency of si-α7nAChR was determined by Western blot (A). The mRNA and protein levels of HMGB1 were detected by RT-PCR (B) and Western blot (C), respectively. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsLPS group;#P<0.05vsLPS+CLO+si-mock group.

图4 沉默α7nAChR对HMGB1 mRNA和蛋白表达水平的影响

讨 论

ALI的本质可能是一种肺内过度性、失控性的炎症反应，内毒素及其诱发的炎症介质的过度释放是导致ALI的重要原因。致炎细胞因子是引起机体失控性炎症反应和组织损害的关键介质。越来越多的证据表明过度产生的炎性细胞因子如TNF-α、IL-1β等已成为影响ALI/ARDS起病和发展的关键因素[14]。

可乐定是一种α2-肾上腺素受体激动剂，具有镇静作用[15-16]，可以单独使用也可与其它麻醉联合用药。研究表明，可乐定可以减轻低氧大鼠创伤后的炎性反应[17]。右美托咪定也是一种α2-肾上腺素受体激动剂，右美托咪定可以抑制炎性反应从而减轻脓毒血症引起的ALI，具有明显的肺保护作用，因此我们大胆猜测可乐定在ALI是否也有类似的抗炎作用。本文以LPS诱导的肺损伤BALB/c小鼠为研究模型，静脉注射可乐定后发现，肺组织中炎性因子IL-6、IL-10和TNF-α的含量明显降低，且肺湿干重比和总肺含水量也显著下降，表明可乐定可抑制炎症反应，对肺损伤具有缓解作用。

胆碱能抗炎通路主要通过刺激α7nAChR对炎症反应发挥免疫调节作用[18]。其在脾脏、肝脏和胃肠道等网状内皮系统通过释放乙酰胆碱抑制细胞因子的合成，控制炎症反应[19]。α7nAChR是烟碱型乙酰胆碱受体的一个重要亚型，分布广泛且功能多样，参与功能调节及功能障碍相关疾病的病理生理过程。有研究表明，右美托咪定对脓毒症大鼠有明显的抗炎作用，可能是通过激活胆碱能抗炎通路而产生的，α7nAChR激动剂PNU-282987对大鼠肠缺血再灌注后肺组织中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的产生具有抑制作用[20]。HMGB1是一个高度保守的蛋白，广泛分布于几乎所有类型细胞的细胞核和细胞质中。Wang等[21]首次报道HMGB1作为新的潜在的炎症介质参与了脓毒症的发病过程，是内毒素致死效应的重要炎症介质；HMGB1可促进炎性因子IL-1β和TNF-α的释放[22]，还有研究表明，右美托咪定通过抑制HMGB1的表达，从而抑制TLR4介导的一系列炎症反应。本研究通过检测肺损伤小鼠肺组织中α7nAChR和HMGB1的表达发现，肺损伤导致α7nAChR被减弱而HMGB1过表达，可乐定可促进α7nAChR的表达水平，即激活胆碱能抗炎通路，HMGB1的表达明显下调。进一步探究可乐定的作用机制，结果显示，抑制α7nAChR或过表达HMGB1都会加重炎症因子的生成，且α7nAChR可负向调控HMGB1的表达。

综上所述，可乐定可减轻LPS诱导的大鼠肺损伤，抑制炎性反应，从而抑制肺损伤，其机制可能与激活胆碱能抗炎通路、促进α7nAChR而下调HMGB1的表达有关。本研究为可乐定的作用机制提供了新的依据和思路，对其在肺损伤中的肺保护作用还需要进一步的研究探讨。

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(责任编辑： 陈妙玲, 罗 森)

Clonidine inhibits inflammatory response in lung injury mice through cholinergic anti-inflammatory pathway

LIU Yan-feng1, LIU Zhan2

(1DepartmentofAnesthesia,TheFirstAffiliatedHospitalofNanyangMedicalCollege,2TheFirstDepartmentofAnesthesia,NanyangCentralHospital,Nanyang473000,China.E-mail:liuzhan2016@qq.com)

AIM: To explore the influence of clonidine on inflammatory response in lung injury mice and its possible mechanism. METHODS: Clonidine solution was intravenously injected into the mice with lung injury induced by LPS. The left upper lobe of the lung was collected to detect lung wet/dry weight ratio (W/D) and total lung water content (TLW). The concentrations of IL-6, IL-1β and TNF-α were measured by ELISA. The expression of α7 nicotinic acetylcholine receptor (α7nAChR) and high-mobility group box protein 1 (HMGB1) at mRNA and protein levels was determined by RT-PCR and Western blot. After importingα7nAChRsiRNA lentiviral vector or injecting exogenous HMGB1 protein, the inflammatory cytokines were detected. RESULTS: Clonidine attenuated lung injury and inhibited inflammatory reaction. Clonidine promoted the activation of cholinergic anti-inflammatory pathway by promoting α7nAChR expression. Clonidine inhibited HMGB1 expression, which promoted the secretion of IL-6, IL-1β and TNF-α. HMGB1 was negatively regulated by α7nAChR.CONCLUSION: Clonidine functions as an anti-inflammatory reagent to the lung injury mice. The mechanism may be related to activating the cholinergic anti-inflammatory pathway and inhibiting the expression of HMGB1.

Clonidine; Lung injury; Inflammatory reaction; Cholinergic anti-inflammatory pathway; α7 nicotinic acetylcholine receptor; High-mobility group box protein 1

1000- 4718(2017)07- 1283- 05

2016- 11- 18

2017- 02- 20

R614； R363.2； R965

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.021

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 13733128296; E-mail: liuzhan2016@qq.com