马 丽， 官滨斌， 王林曦,， 刘小莺， 陈 洲， 刘礼斌, 4△

(福建医科大学 1附属协和医院内分泌科，福建省内分泌研究所， 2附属协和医院老年病科，3药学院， 4老年健康科学研究院，福建 福州 350001)

Exendin-4可通过下调内质网应激信号标志蛋白表达改善3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗*

马 丽1， 官滨斌1， 王林曦1,2， 刘小莺2， 陈 洲3， 刘礼斌1, 4△

(福建医科大学1附属协和医院内分泌科，福建省内分泌研究所，2附属协和医院老年病科，3药学院，4老年健康科学研究院，福建 福州 350001)

目的： 探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)受体激动剂exendin-4对内质网应激(ERS)诱导剂衣霉素(TM)介导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)的影响。方法: 体外培养3T3-L1脂肪细胞，分别用TM、内质网应激抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(TUDCA)及exendin-4进行干预，以MTT法检测不同干预条件下脂肪细胞的存活情况，以葡萄糖氧化酶法检测不同干预条件下脂肪细胞的葡萄糖消耗量情况，利用Western blot法检测不同干预条件下p-Akt、Akt及ERS关键信号标志蛋白肌醇需求蛋白1(IRE1)、p-IRE1、c-Jun末端激酶(JNK)、p-JNK、蛋白激酶R样内质网激酶(PERK)、p-PERK、真核生物翻译起始因子2的α亚单位(eIF2a)、p-eIF2a和转录激活因子(ATF)-6的蛋白水平。结果: 单独TUDCA或exendin-4作用，可协同胰岛素作用，增加胰岛素刺激的脂肪细胞葡萄糖消耗量(P<0.05)。TM(5 mg/L)作用5 h后可减少胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞萄糖消耗量(P<0.05)及p-Akt的蛋白水平(P<0.05)。TUDCA(1 mmol/L)或exendin-4(100 nmol/L)预处理24 h后，均可拮抗TM对胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞萄糖消耗量(P<0.05)及p-Akt蛋白水平的改变(P<0.05)，二者效价相当。TM(5 mg/L)作用5 h后可显著提高ERS标志蛋白的表达。而exendin-4(100 nmol/L)预处理24 h后，可降低TM诱导的ERS标志蛋白的表达，其效价与应用内质网应激抑制剂TUDCA(1 mmol/L)预处理24 h相当。不同的处理因素对于总IRE1、JNK、PERK及eIF2a的表达情况并无显著性影响。结论: Exendin-4可改善内质网应激介导的3T3-L1脂肪细胞的胰岛素抵抗。

Exendin-4； 内质网应激； 3T3-L1脂肪细胞； 胰岛素抵抗

目前已有大量研究证实，胰岛素(insulin，INS)抵抗(insulin resistance，IR)常常与肥胖、糖尿病、心血管疾病、高脂血症相伴随，被认为是滋生多种代谢性疾病的“共同土壤”[1-2]。而肥胖常伴有炎症反应和全身代谢絮乱，是引起IR最常规的原因。近年来研究发现[3]，内质网应激(endoplasmic reticulum stress， ERS)与胰岛素抵抗密切相关，减轻细胞的内质网应激将是治疗胰岛素抵抗的新靶点。胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1，GLP-1)作为近年来备受关注的糖尿病治疗药物，具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌、延缓胃排空、保护胰岛β细胞、促进骨骼肌及脂肪组织中胰岛素刺激的糖转运活动、促进糖原合成及改善外周组织的胰岛素敏感性等诸多优点。现已有报道在体外研究中，GLP-1的类似物exendin-4(EX-4)可以减轻内质网应激[4-5]。但对于脂肪细胞中，GLP-1类似物是否可以通过减轻内质网应激改善胰岛素抵抗，目前国内外文献鲜见报道。本研究将以3T3-L1脂肪细胞为研究对象，利用内质网应激诱导剂衣霉素(tunicamycin，TM)诱导3T3-L1脂肪细胞发生胰岛素抵抗，并从exendin-4对内质网应激未折叠蛋白质应答相关的IRE1-JNK、PERK-eIF2a和ATF-6 这3条通路的作用入手，探讨exendin-4改善TM诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗的分子机制，为更好地理解exendin-4的抗糖尿病作用提供理论依据。

材 料 和 方 法

1 材料

3T3-L1前脂肪细胞由上海瑞金医院内分泌研究所惠赠；高糖DMEM、胎牛血清和胰蛋白酶(Gibco)；低糖DMEM(Hyclone)；IBMX、地塞米松和衣霉素(Sigma)；优泌林R(Lilly)；牛磺熊脱氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid，TUDCA；Calbiochem)；葡萄糖测定试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司)；抗p-JNK多克隆抗体、抗JNK多克隆抗体、抗肌醇需求酶1(inositol requirirg enzyme-1，IRE1)多克隆抗体、抗磷酸化的真核生物翻译起始因子2的α亚单位(eukaryotic initiation factor 2 alpha,eIF2a)单克隆抗体、抗p-Akt单克隆抗体(CST)；抗p-IRE1多克隆抗体、抗转录激活因子(activating transcription factor，ATF)-6多克隆抗体和抗p-PERK单克隆抗体(Abcam)；抗蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK)单克隆抗体和抗eIF2a单克隆抗体(Santa Cruz)；抗Akt多克隆抗体(武汉博士德)；辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG(中杉金桥生物科技公司)；蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术研究所)。二氧化碳细胞培养箱(SANYO)；酶标仪ELX8(Bio-Tek)。

2 方法

2.1 细胞的培养与诱导分化 3T3-L1前脂肪细胞以含10%小牛血清的高糖DMEM培液在37 ℃、5% CO2培养箱中培养。细胞融合达80%～90%时，以0.25%胰蛋白酶消化、传代接种至6孔培养板上。待细胞融合2 d后，加含0.5 mmol/L异丁基-甲基-黄嘌呤、1 μmol/L地塞米松和10 mg/L胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养48 h，换液，以含10 mg/L胰岛素的10%小牛血清高糖DMEM培养液再培养48 h，随后换单纯10%小牛血清高糖DMEM继续培养，2 d换培养液1次，诱导分化8～12 d，细胞内可见明显脂滴，可用于实验[6]。

2.2 油红O染色法鉴定脂肪细胞 以10%多聚甲醛固定细胞10 min，PBS 洗去后晾干。加油红O染液(0.25 g油红O加入100 mL异丙醇，56 ℃溶解1 h，冷却后，过滤作为储存液；使用时，取6份上述储存液，加4份ddH2O混匀，静置10 min，即为使用液)10 min后弃去，以异丙醇洗细胞2次，用苏木精染细胞核2 min。水洗5～10 min，倒置显微镜下观察结果，拍摄照片[5]。细胞内的脂滴被染成红色，说明诱导成功。

2.3 实验分组 将诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞分为空白对照(control)组、INS组、TM组、TM+TUDCA组、TUDCA组、TM+EX-4组、EX-4组。(1)空白对照组：不加任何干预因素；(2)INS组：仅胰岛素处理30 min；(3)TM组：TM(5 mg/L)作用5 h后，胰岛素作用30 min；(4)TM+TUDCA组：以TUDCA(1 mmol/L)预处理24 h后，以TM(5 mg/L)作用5 h，胰岛素作用30 min；(5)TUDCA组：TUDCA(1 mmol/L)预处理24 h后，胰岛素作用30 min；(6)TM+EX-4组：exendin-4(100 nmol/L)预处理24 h后,以TM(5 mg/L)作用5 h，胰岛素作用30 min；(7)EX-4组：以exendin-4(100 nmol/L)预处理24 h，胰岛素作用30 min。

2.4 细胞存活率的检测 于96孔培养板中每孔接种100 μL的细胞，按 2.1所述方法诱导细胞为成熟的脂肪细胞，按照上述分组予以不同的干预条件，每孔加入5 g/L MTT溶液10 μL，37 ℃孵育4 h，吸净上清，每孔加入DMSO 150 μL，室温振荡10 min，混匀后置于酶标仪测定490 nm处吸光度(A)值，以监测细胞活力。

2.5 测定3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量 将96孔板中诱导分化成熟的3T3-L1脂肪细胞按上述分组中的不同条件予以干预，用葡萄糖氧化酶法检测培养液中的葡萄糖含量，与未接种细胞空白复孔的糖含量均值相减，算出各孔细胞的葡萄糖消耗量[7]。

2.6 Western blot检测内质网应激相关通路蛋白(p-Akt、Akt、p-IRE1、IRE1、p-JNK、JNK、p-PERK、PERK、p-eIF2a、eIF2a和ATF-6)的水平 用细胞裂解法抽提蛋白，分别配制8%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，每孔上样30 μg，30 V恒压预跑10 min，80 V恒压电泳跑至浓缩胶和分离胶分界线，120 V恒压电泳90 min。电泳完成采用300 mA恒电流转膜90 min。50 g/L脱脂奶粉封闭2 h。I 抗孵育过夜。TBST洗脱10 min、3次；II 抗孵育1 h。TBST洗脱10 min、3次。ECL发光法显色，在暗室中曝光，并以β-actin作为内参照。蛋白条带灰度值运用Image J软件进行半定量分析。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件进行统计分析。所有实验独立3次完成，结果用均数±标准差(mean±SD)表示，多组间比较采用完全随机设计的单因素方差分析，其中组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 各处理因素对3T3-L1脂肪细胞活性的影响

与未经任何处理的空白对照组比较，各处理因素组细胞存活率无显著差异，表明各处理因素对细胞活力无影响，见图1。

2 TM诱导3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗及exendin-4对葡萄糖消耗量的影响

与空白对照组比较，经10 nmol/L胰岛素处理30 min后，3T3-L1脂肪细胞萄糖消耗量明显升高(P<0.05),说明诱导分化的3T3-L1脂肪细胞对胰岛素敏感，适用于建立IR模型。与INS组相比，TM(5 mg/L)作用5 h后可减少胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞萄糖消耗量，较INS组减少了 63%(P<0.05)。经过TUDCA(1 mmol/L)以及exendin-4(100 nmol/L)预处理24 h后，均可增加胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞萄糖消耗量，较TM组分别增加了62%及63%(P<0.05)，二者效价相当。单独TUDCA或exendin-4作用，可协同胰岛素作用，增加胰岛素刺激的3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗，较INS组分别增加了18%及17%(P<0.05)，见图2。

Figure 1.The cell viability of 3T3-L1 adipocytes in different groups. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.

图1 不同处理因素对3T3-L1脂肪细胞存活率的影响

Figure 2.Glucose consumption in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsINS group;&P<0.05vsTM group.

图2 不同处理因素对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗量的影响

3 Western blot检测p-Akt/Akt在各组间的变化情况

INS组较空白组的p-Akt蛋白水平升高(P<0.05)，而TM组较INS组的p-Akt蛋白水平降低(P<0.05)。而TUDCA(1 mmol/L)或exendin-4(100 nmol/L)预处理24 h后，可升高TM诱导的p-Akt蛋白水平 (P<0.05)。结果说明，TM组存在胰岛素抵抗，exendin-4可能通过激活p-Akt，减轻TM介导3T3-L1脂肪细胞产生的胰岛素抵抗，见图3。

Figure 3.The ratio of phosphorylated Akt (p-Akt)/Akt in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsINS group;&P<0.05vsTM group.

图3 Western blot显示各组3T3-L1脂肪细胞中p-Akt和Akt的蛋白表达情况

4 Western blot检测内质网应激相关通路蛋白在各组间的变化情况

TM作为内质网应激诱导剂可显著提高内质网信号通路分子p-IRE1、p-JNK、p-eIF2a、p-PERK和ATF-6的水平(P<0.05)。而exendin-4(100 nmol/L)预处理24 h后，可抑制TM诱导的p-IRE1、p-JNK、p-eIF2a、p-PERK和ATF-6蛋白水平(P<0.05)，其效价与应用内质网应激抑制剂TUDCA(1 mmol/L)预处理24 h相当。不同的处理因素对于总IRE1、JNK、eIF2a和PERK的表达情况并无显著影响。结果说明exendin-4可减轻TM诱导的3T3-L1脂肪细胞产生的内质网应激，见图4、5。

讨 论

目前研究认为，胰岛素抵抗与多种疾病相关，它是糖尿病、高血压、肥胖、动脉粥样硬化等多种代谢相关疾病的共同发病基础[8]。改善胰岛素抵抗或能延缓或逆转相关疾病的发生和发展。因此，研究IR的发生机制及治疗措施已成为当前的重要课题。

目前已有不少研究发现内质网应激与IR密切相关。ERS是指由于某种原因使细胞内质网生理功能发生紊乱的一种病理状态，在血糖和能量改变、蛋白质合成增加、中毒、病毒感染及内质网内钙稳态失调时，内质网的功能出现紊乱，导致蛋白质折叠障碍和错误折叠，进而触发ERS，在这种情况下，内质网激活一系列复杂的反应来重新恢复它的整体功能，这个过程称为未折叠蛋白质反应[9-10]。目前研究发现，脂肪细胞内质网应激可能通过以下几个途径阻碍胰岛素信号通路转导引起胰岛素抵抗：(1)内质网应激发生未折叠蛋白反应时IRE-1α磷酸化水平升高，通过募集肿瘤坏死因子受体相关因子-2及凋亡信号调节激酶-1，这3者形成复合物共同激活JNK进而活化丝氨酸激酶，促进胰岛素受体底物-1 关键位点的丝氨酸残基磷酸化，从而抑制磷脂酰肌醇-3-激酶介导的胰岛素信号转导通路，降低靶组织对胰岛素的敏感性[11]；(2)PERK可以直接降解NF-κB的抑制因子IκB蛋白，继而激活NF-κB通路，从而上调TNF-α、IL-6和MCP-1等炎症基因的表达，导致IR[12]；(3)在3T3-L1脂肪细胞中，内质网应激还可导致葡萄糖转运子-4表达下降，减少脂肪细胞中葡萄糖的转运产生胰岛素抵抗[13]。可见，ERS可以影响胰岛素信号转导，进而导致IR和代谢异常。在本研究中，首先经MTT法检测显示，各分组的不同干预条件并未引起细胞凋亡；但经内质网应激诱导剂TM处理的3T3-L1脂肪细胞，胰岛素刺激的葡萄糖摄取量减少， Western blot检测p-Akt的分子水平下降，而ERS相关信号通路蛋白IRE1、JNK、PERK、eIF2a及ATF-6表达均上调。TUDCA作为一种能减轻细胞ERS的化学分子伴侣，在实验中，发现经其预处理后的3T3-L1脂肪细胞，TM诱导的上述葡萄糖消耗量增多、p-Akt表达的升高及内质网应激标志蛋白的表达下降，此结果也与Ozcan等[14]的结果相一致。由此推测，TM可能通过介导脂肪细胞的内质网应激，引起下游的胰岛素受体信号通路相关信号分子表达下调，导致IR，而TUDCA能通过减轻ERS，改善IR。

Figure 4.The ratio of p-IRE1/IRE1 and p-JNK/JNK in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsINS group;#P<0.05vsTM group.

图4 Wester blot迹显示各组3T3-L1脂肪细胞中p-IRE1、IRE1、p-JNK和JNK的蛋白水平

Figure 5.The ratio of p-eIF2a/eIF2a, p-PERK/PERK and ATF-6/β-actin in the 3T3-L1 adipocytes with different treatments. TU: TUDCA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsINS group;#P<0.05vsTM group.

图5 各组3T3-L1脂肪细胞中p-eIF2a、eIF2a、p-PERK、PERK及ATF-6的蛋白水平

GLP-1是一种重要的肠促胰岛素，除葡萄糖依赖性的降低血糖，刺激胰岛β细胞分化、增殖以及抑制食欲、延缓胃排空外，亦有部分研究发生其还参与外周组织包括肝脏、骨骼肌和脂肪组织的葡萄糖代谢，并增加脂肪合成及分解，改善细胞的胰岛素敏感性[15]。GLP-1在体内半衰期极短，分泌入血后1～2 min即被二肽基肽酶IV所降解。而exendin-4 作为GLP-1 类似物，具有GLP-1相似的生物学作用，同时不易被二肽基肽酶IV降解，血浆半衰期长，在临床及科研的应用中更具优势。目前亦有体外及动物实验报道，exendin-4可通过PI3K-PKB信号通路或增加葡萄糖转运子的表达增加其转运效率、协同胰岛素作用并提高胰岛素刺激的葡萄糖摄取，改善大鼠骨骼肌及肝脏的胰岛素抵抗[16-17]。本实验结果也显示，exendin-4可提高TM诱导的3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗模型鼠的葡萄糖摄取量及p-Akt蛋白的表达水平，提示exendin-4可改善脂肪细胞的胰岛素抵抗。另外，还有一些体外研究发现，exendin-4对人脐静脉内皮细胞的内质网应激损伤起拮抗作用[4]；在啮齿动物体内研究中发现，exendin-4的治疗减少胰腺中CHOP、XBP-1及BiP等内质网应激标志物的表达[5]。鉴于内质网应激与胰岛素抵抗的相关性，本实验还进一步观察了内质网应激相关信号通路蛋白IRE1、JNK、PERK、eIF2a及ATF-6表达情况，发现exendin-4降低TM诱导的p-IRE1、p-JNK、p-PERK、p-eIF2a及ATF-6的蛋白水平，且其效价与ERS抑制剂TUDCA相当，而对总IRE1、JNK、PERK和eIF2a表达影响不大。由此推测exendin-4可能通过下调上述内质网应激信号通路分子来发挥其改善外周脂肪组织胰岛素抵抗的作用。

总之，exendin-4可能通过减轻内质网应激改善脂肪细胞的胰岛素抵抗作用。但具体的作用机制如胰岛素受体信号通路的变化情况以及是否还可以通过影响炎症信号通路NF-κB等发挥改善胰岛素抵抗的作用，仍有待进一步的研究。

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(责任编辑： 陈妙玲， 余小慧)

Exendin-4 improves insulin resistance by declining expression of endoplasmic reticulum stress markers in 3T3-L1 adipocytes

MA Li1, GUAN Bin-bin1, WANG Lin-xi1, 2, LIU Xiao-ying2, CHEN Zhou3, LIU Li-bin1, 4

(1DepartmentofEndocrinology,FujianInstituteofEndocrinology,2DepartmentofGeriatrics,FujianMedicalUniversityUnionHospital,3CollegeofPharmacy,4InstituteoftheElderlyHealthSciences,FujianMedicalUniversity,Fuzhou350001,China.E-mail：libin.liu@hotmail.com)

AIM: To explore the effects of exendin-4 (EX-4) on endoplasmic reticulum stress (ERS)-mediated insulin resistance in the 3T3-L1 adipocytes. METHODS:Invitro3T3-L1 pre-adipocytes were differentiated into adipocytes, and the cells were treated with tunicamycin (TM), tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) or EX-4， respectively. The cell viability was measured by MTT assay. The glucose consumption was determined by glucose oxidase assay to evaluate insulin sensitivity of the 3T3-L1 adipocytes with different interventions. The protein levels of p-Akt, Akt and endoplasmic reticulum stress markers, including inositol requiring enzyme-1 (IRE1)， p-IRE1, JNK, p-JNK, protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase (PERK), p-PERK, eukaryotic initation factor 2 alpha (eIF2a)， p-eIF2a, activating transcription factor-6(ATF-6) were detected by Western blot. RESULTS: The insulin-stimulated glucose consumption and the protein level of p-Akt were inhibited by TM at 5 mg/L for 5 h (P<0.05), while they were increased when the cells were treated with TUDCA at 1 mmol/L or EX-4 at 100 nmol/L for 24 h (P<0.05). The effects above induced by TM (5 mg/L for 5 h) were also blunted by pretreating with TUDCA at 1 mmol/L or EX-4 at 100 nmol/L for 24 h (P<0.05). The protein levels of ERS markers such as p-IRE1, p-JNK, p-PERK, p-eIF2a and ATF-6 were significantly increased by treating with TM at 5 mg/L for 5 h, whereas 24 h pre-treatment with TUDCA or Ex-4 alleviated the ERS of the 3T3-L1 adipocytes induced by TM. The expression of total IRE1, JNK, PERK and eIF2a was not changed in different groups. CONCLUSION: Exendin-4 improves endoplasmic reticulum stress mediated insulin resistance in 3T3-L1 adipocytes.

Exendin-4; Endoplasmic reticulum stress; 3T3-L1 adipocytes; Insulin resistance

1000- 4718(2017)07- 1258- 06

2016- 06- 23

2017- 05- 22

福建省科技重点项目(No. 2013Y0041)； 福建省卫生厅青年课题(No. 2009-2-24)； 国家重点学科老年医学项目资助(No. 2015-GJLN-2-04)； 福建省卫计委青年项目(No. 2014-1-43； No. 2015-1-38)

R587.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.017

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△通讯作者 Tel： 0591-83357896-8423； E-mail： libin.liu@hotmail.com