王成绩

(安徽省巢湖学院体育学院， 安徽 巢湖 238000)

运动干预糖尿病心肌病的分子机制研究

王成绩△

(安徽省巢湖学院体育学院， 安徽 巢湖 238000)

目的： 观察链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠心肌组织中NADPH氧化酶表达的变化，探讨运动对NADPH氧化酶的影响。方法: 大鼠糖尿病模型建立成功1周后，测定糖尿病对心肌组织中NADPH氧化酶亚基表达的影响，测定8周的运动能否有效影响NADPH氧化酶亚基的表达；观测糖尿病对心肌胶原蛋白表达的影响，8周运动是否能够影响胶原蛋白的表达。结果: 糖尿病导致心室NADPH氧化酶亚基p47phox和 gp91phox表达增加，而8周运动能够抑制这2种亚基表达的增加；糖尿病引起心房肌p47phox表达显著增加，运动抑制其增加；糖尿病大鼠心肌胶原蛋白III水平显著增加，运动降低胶原蛋白的增加。结论: 运动减低糖尿病大鼠心脏p47phox和 gp91phox的表达。这可能是改善心内基质的重要机制，因此运动干预糖尿病心肌病的一个有效机制可能是通过抑制心肌氧化应激和降低胶原蛋白的表达。

糖尿病心肌病； NADPH氧化酶； 运动； 胶原蛋白Ⅲ

中等强度和频率的有氧运动是慢性心衰患者的心脏康复措施之一[23]。运动降低血浆Ang II水平[24-26]。但是，运动对糖尿病患者NADPH氧化酶活性及其亚基表达的影响还不完全清楚。本研究探讨糖尿病是否能够诱导p47phox和gp91phox表达增加，观察糖尿病心肌病与这些亚基表达的增加存在什么样的关系，同时确定运动是否能够改善/降低糖尿病诱导的这些亚基的表达增加，进而探讨运动对糖尿病心肌病的保护机制。

材 料 和 方 法

1 实验材料

动物实验跑台(安徽正华生物仪器设备有限公司); 链脲佐菌素(streptozotocin，STZ； Sigma);柠檬酸合酶试剂盒(北京绿源博德生物科技有限公司);Anti-p47phox抗体(上海瑞齐生物科技有限公司);兔抗人多克隆抗体gp91phox(Abcam);Goat Anti-Type III Collagen(武汉艾美捷科技有限公司)；SelectCycler II 梯度PCR仪(上海巴玖实业有限公司)。

2 实验方法

2.1 糖尿病大鼠模型的建立 80只雄性SD大鼠，体重190～200 g，购于南京君科生物工程有限公司。饲养习服1周后，建立糖尿病模型，一次腹膜内注射65 mg/kg STZ (溶于2% 0.1 mmol/L冷却柠檬酸缓冲液，pH 4.5)。注射48 h后空腹血糖>13.89 mmol/L时为建模成功。对照组大鼠注射不含STZ的柠檬酸缓冲液。整个研究中，体重相似大鼠配对饲养，室温22 ℃，12 h光照循环，湿度30%～40%。自由饮食。

2.2 运动方案 建模成功1周后，对照组和糖尿病组大鼠分别随机分为2组。对照组和糖尿病组中的1组不运动，其他2组根据修正的Musch等[27]的运动方案进行8周运动。4组分别为不运动正常对照(normal control， NC)组、不运动糖尿病(diabetic control， DC)组、运动对照(exercise control， EC)组和糖尿病运动(diabetic exercise， DE)组。适应期中，大鼠运动时间为每天5～15 min，跑台初始速度为10 m/min，坡度为0，共5 d，目的是确保有效的耐力运动。接着跑台坡度和速度逐渐增加到10%和25 m/min，运动持续时间增加到每天60 min。2组对照组除跑台运动外，其它日常处理与2组运动组一样。

2.3 样本收集 实验结束后，4组大鼠用过量戊巴比妥麻醉(65 mg/kg，肌注)，建模过程中，无死亡案例。胸腔切开，摘取心脏，液氮中快速冷冻，-80℃保存。摘取后肢比目鱼肌，快速冷冻，-80℃保存。

2.4 柠檬酸合酶分析 根据先前的方法[28]，通过测量肌肉匀浆中柠檬酸合酶的活性评价运动效应。柠檬酸合酶活性依据总蛋白含量进行标化，用mmol·g-1·min-1表示。

2.5 半定量RT-PCR 用半定量RT-PCR测定左右心室和心房组织中的p47phox和gp91phox相对水平。左右心室在低温恒温器上切成100 μm厚的冠状切片，15号穿刺针穿刺心房取样(左心耳部心房肌)。用TRIzol试剂法提取左右心室和心房组织总RNA。4组取等量总RNA (1 μg)，在37 ℃含有随机六聚物和100 U M-MLV逆转录酶中逆转录40 min。p47phox和gp91phox引物用于聚合酶链反应，测定每个样本的转录量。β-肌动蛋白共同扩增作为内参照。

反应条件为： 94 ℃ 4 min； 94 ℃ 30 min， 66 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min， 35个循环； 72 ℃ 7 min。反应结束时，从每份PCR反应中取7 μL与蓝/橙上样染料混合，在100 V，用1%含溴乙啶琼脂凝胶电泳45 min。用凝胶成像系统显影凝胶。用柯达分析软件分析谱带强度，用各自相对的β-肌动蛋白谱带进行标化。p47phox的上游引物为5’-ACCTGTCGGAGAAGGTGGT，下游引物为5’-TAGGTCTGAAGGATGATGGG；gp91phox的上游引物为5’-CATTTACCACTGTGCTTGGCA-3’，下游引物为5’-CCAGAGTCATGGCAGGAGGT-3’。

2.6 Western blot 用Western blot法分析4组大鼠左室、右室和心房组织p47phox和gp91phox。心脏在含1mmol/L苯甲磺酰基氟化物和蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液中匀浆后提取蛋白质。测量心房胶原蛋白III水平作为心肌硬化的一个指标，每份蛋白样本30～40 μg与等量4% SDS样本缓冲液，分馏到7.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上，转移到PVDF膜上。转移后，室温下用含5%脱脂奶粉TBST阻断PVDF膜1 h。接着，4 ℃用 I 抗-p47phox兔多克隆抗体，兔抗人gp91phox多克隆抗体，抗-胶原蛋白III山羊多克隆抗体孵育过夜，与相应过氧化物酶结合第 II 抗体孵化1 h。用增强化学发光可视化信号，用UVP数字成像系统检测，用ImageJ软件定量信号。

3 统计学处理

所有数据均用均数±标准差(mean±SD)表示，多组比较采用单因素方差分析，各组均数间的两两比较用Student-Newman-Keuls检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠的一般特征

表1显示4周后4组大鼠的特征。研究初始，大鼠平均体重为(196±4) g。8周后，NC组大鼠平均体重增加到(298±12)g，但EC组平均体重为(213±8) g。DC组平均体重为(213±11)g，DE组平均体重为(210±7) g 。实验过程中，NC和EC组大鼠空腹血糖水平没有显著变化，分别为(3.78±0.66) mmol/L和(4.22±0.50) mmol/L。DC组空腹血糖显著增高到(21.44±0.83) mmol/L，DE组为(18.44±0.72) mmol/L。腓肠肌中柠檬酸合酶活性的测定结果表明，运动增加骨骼肌线粒体体积和数量，增加肌肉的呼吸能力。增加的线粒体转而增加柠檬酸合酶活性，反映运动相关肌肉活性的增加。由表1可见，NC组柠檬酸合酶活性(4.33±0.56) mmol·g-1·min-1，DC组为(4.08±0.36) mmol·g-1·min-1，DC组稍低，但差异无统计学意义。EC组为(7.05±0.33) mmol·g-1·min-1，DE组为(7.12±0.42) mmol·g-1·min-1，运动显著增加柠檬酸合成酶的活性(P<0.05)。

表1 4组大鼠的特征

Table 1.The characteristics of the rats with different treatments (Mean±SD.n=20)

TreatmentBodyweight(g)FBG(mmol/L)Citratesynthase(mmol·g-1·min-1)NC298±123.78±0.664.33±0.56DC213±11**21.44±0.83**4.08±0.36EC213±8**4.22±0.507.05±0.33**DE210±7**18.44±0.72#7.12±0.42**#

**P<0.01vsNC group;#P<0.05vsDC group.

2 糖尿病大鼠左室p47phox和gp91phox表达增加，运动可以减缓增加

8周后，与NC组相比，DC组左室p47phox和gp91phox的mRNA和蛋白表达水平均显著增加(P<0.05)。8周的运动使大鼠左室p47phox和gp91phoxmRNA和蛋白表达水平均降低，与DC组相比差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

Figure 1.The expression of p47phoxand p91phoxat mRNA and protein levels in the left ventricle of the rats with different treatments. A: the mRNA expression of detected p47phoxby RT-PCR; B: the protein expression of p47phoxdetected by Western blot; C: the mRNA expression of gp91phoxdetected by RT-PCR; D: the protein expression of gp91phoxdetected by Western blot. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDC group.

图1 4组大鼠左室p47phox和 gp91phox的表达

3 运动降低糖尿病大鼠引起的右室p47phox和gp91phox的增加

DC组右室p47phox的mRNA和蛋白质表达与NC组相比差异没有统计学显著性；右室gp91phox的mRNA表达水平显著增加(P<0.05)，但2组间gp91phox蛋白质表达的差异没有统计学显著性。与DC组相比，8周运动降低 p47phox和gp91phox的mRNA表达水平(P<0.05)，见图2。

Figure 2.The expression of p47phoxand p91phoxat mRNA and protein levels in the right ventricle of the rats with different treatments. A: the mRNA expression of p47phoxdetected by RT-PCR; B: the protein expression of p47phoxdetected by Western blot; C: the mRNA expression of gp91phoxdetected by RT-PCR; D: the protein expression of gp91phoxdetected by Western blot. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDC group.

图2 4组大鼠右室p47phox和 gp91phox的表达

4 运动能够降低糖尿病大鼠心房p47phox和gp91phox表达增加

由图3可见，与NC组相比，DC组大鼠心房p47phox和 gp91phox的mRNA表达水平显著增加(P<0.05)。与预期的一样，与DC组相比，运动8周后，DE组心房p47phox和 gp91phox的mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。与NC组相比，DC组p47phox蛋白质表达显著增加(P<0.05)，而gp91phox蛋白质的表达水平没有增加。EC组和DE组心房p47phox的mRNA和蛋白质表达降低与运动降低心房p47phox的mRNA表达水平增加的状况相似。

5 运动降低糖尿病诱导的心房胶原蛋白III表达的增加

由图4可见，与NC组相比，DC组大鼠细胞外基质蛋白胶原蛋白III显著增加(P<0.05)。8周运动降低糖尿病大鼠胶原蛋白III蛋白表达的增加(P<0.05)，达到与对照组相似的水平，但8周运动没有影响非糖尿病对照组大鼠胶原蛋白III的表达。

Figure 3.The expression of p47phoxand p91phoxat mRNA and protein levels in the atrium of the rats with different treatments. A: the mRNA expression of p47phoxdetected by RT-PCR; B: the protein expression of p47phoxdetected by Western blot; C: the mRNA expression of gp91phoxdetected by RT-PCR; D: the protein expression of gp91phoxdetected by Western blot. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDC group.

图3 4组大鼠心房p47phox和 gp91phox的表达

Figure 4.The expression of collagen III in the atrium of the rats with different treatments. Mean±SD.n=20.*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsDC group.

图4 心房胶原蛋白III表达变化的比较

讨 论

本研究的主要发现是STZ诱导的糖尿病大鼠心脏NADPH氧化酶胞质亚基p47phox和膜结合亚基gp91phox被上调，运动可以降低糖尿病诱导的2种亚基表达的增加。由于运动开始于建模1周后，运动可能预防或减小而不是逆转糖尿病诱导的表达增加。有研究报道，与NC组相比，DC组大鼠缩短分数、射血分数、每搏输出量和心输出量显著降低。8周的运动显著增加射血分数百分比，降低左室收缩末期直径的增加，改善异丙肾上腺素诱导的糖尿病组dp/dt的增加。心脏NADPH氧化酶亚基表达的改变可能与糖尿病心功能改善有关。

线粒体和NADPH氧化酶的递增信息在糖尿病心脏ROS产生中起基础作用。此外，ROS介导过氧亚硝酸盐形成增加诱导体肌细胞凋亡，表明氧化应激是一个常见的凋亡介质，诱导糖尿病大鼠心脏损伤。数据表明糖尿病心脏氧化应激水平增加可能部分原因是NADPH氧化酶亚基上调，这种改变可能被运动降低。这些结果表明运动的有益效应可能与糖尿病心肌病的氧化应激改善有关。NADPH氧化酶在Ang II诱导的心脏肥大和间质纤维化中的关键作用，用靶向破坏NADPH氧化酶亚基gp91phox可以证实。p47phox在激动剂激活酶中起关键作用。

研究表明糖尿病大鼠心组织p47phox和gp91phox表达被上调。左室和心房上调最多，而右室轻微升高。这些发现与临床数据一致，显示糖尿病与收缩舒张和任何左室功能障碍和相对不足的右室危险增加有关。在心室肌细胞，高血糖状态下通过增强增加p47phox蛋白质表达而增加ROS产生，可以被血管紧张素Ⅱ Ⅰ型受体(angiotensinⅡtype 1 receptor， AT1R)拮抗剂阻断。研究显示[29]Ang II灌注通过AT1R活化，诱导主动脉外膜gp91phoxmRNA和蛋白质表达增加。另外，据报道，STZ诱导的糖尿病大鼠主动脉NADPH氧化酶活性增加，gp91phoxmRNA上调[30]。而且，在杜氏肌营养不良大鼠模型中，NADPH氧化酶活性和胶原蛋白III增加与心衰发病机制有关，糖尿病患者心内膜心肌活检也发现胶原蛋白III显著增加。

Ang II可以刺激心肌成纤维细胞合成胶原蛋白I和III，研究提示抑制NADPH氧化酶的活性可以通过降低ROS而延缓Ang II引起的心脏重塑。胶原蛋白稳定状态的增加逐渐增加心室硬化，是糖尿病心肌病一个独特的特征。虽然提出糖尿病心肌病的内科治疗使用不同的抗氧化剂已经几十年，然而，这样的治疗未能降低心功能紊乱或改善结果。这可能是由于缺乏以恰当的方式改善心内膜ROS负担。运动是预防2型糖尿病的一个关键因素被广泛接受，且对心脏病患者存在有益效应，即使这种有益效应的机制还不完全清楚。运动通过延缓糖尿病诱导的心动徐缓，降低心肌收缩力而维持心输出量。动物和临床研究表明运动产生众多有益的生理变化，包括降低血糖、体脂和胰岛素抵抗、改善血糖控制和脂质代谢、改善压力反射敏感性、降低血浆Ang II水平、降低肾交感神经活性和对Ang II应答的动脉血压。另外，运动能够上调心血管系统的抗氧化酶表达和活性。

研究表明，糖尿病诱导的NADPH氧化酶亚基p47phox和gp91phox翻译以及转录的增加，增加心肌氧化应激。糖尿病大鼠心房gp91phox在转录水平的表达增加，但不在蛋白质水平，表明转录增加与组织中蛋白质表达改变不一定相关。

运动通过改善NADPH氧化酶表达和活性，可能减缓糖尿病的发生。运动可以使糖尿病相关血糖、血浆Ang II和TNF-α的增加正常化。这些因素的正常化能降低ROS诱导剂水平，因而抑制NADPH氧化酶活性。另外，有研究指出运动上调主动脉和心脏组织中抗氧化剂表达和活性，如SOD、过氧化氢酶和谷胱甘肽。本研究的重要意义是阐述了运动降低p47phox和gp91phoxmRNA的表达的特殊机制。

综上所述，糖尿病状态下心肌组织NADPH氧化酶亚基p47phox和gp91phox的mRNA表达上调，运动降低NADPH氧化酶亚基表达的上调，使胶原蛋白III的增加正常化。本研究为运动作为调节糖尿病心脏氧化应激水平的一种有效非药物工具的潜在机制提供支持。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Molecular mechanism of exercise intervention in diabetic cardiomyopathy in rats

WANG Cheng-ji

(CollegeofPhysicalEducation,ChaohuUniversity,Chaohu238000,China.E-mail：wcjch2008@126.com)

AIM: To investigate the effect of streptozotocin-induced diabetes on the expression of NADPH oxidase, and to determine the effect of exercise on the expression of NADPH oxidase. METHODS: One weeks after successful modeling, the effect of diabetes mellitus on the expression of NADPH oxidase subunits in the cardiac tissue was determined. The effect of exercise for 8 weeks on the protein expression of NADPH oxidase subunits and the effect of diabetes on the protein expression of collagen in the heart were observed, and whether 8 weeks of exercise affected the expression of collagen were also measured. RESULTS: Diabetes mellitus resulted in the increased expression of NADPH oxidase subunits p47phoxand gp91phoxin the cardiac ventricle, and exercise for 8 weeks inhibited the increase in the expression of NADPH oxidase subunits p47phoxand gp91phox. Diabetes mellitus significantly increased the expression of p47phoxin the atrial muscle, while exercise inhibited this increase. Diabetes mellitus significantly increased the levels of cardiac collagen III, while exercise reduced the increase in collagen protein. CONCLUSION: Reduction of diabetic rat heart p47phoxand gp91phoxexpression by effective exercise therapy may be an important mechanism of improving the cardiac matrix by inhibiting myocardial oxidative stress and decreasing collagen expression, thus preventing diabetic cardiomyopathy.

Diabetic cardiomyopathy; NADPH oxidase; Exercise; Collagen III

1000- 4718(2017)07- 1244- 07

2016- 10- 17

2017- 02- 21

R587.1； R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.015

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel: 13856531173; E-mail： wcjch2008@126.com