吕青兰， 孙 丽， 蒋碧梅， 刘艳娟， 李媛彬， 陈广文， 刘梅冬， 肖献忠

(中南大学湘雅医学院病理生理学系， 湖南 长沙 410078)

核仁素对小鼠糖尿病性心肌病心肌肥大与纤维化发生的影响*

吕青兰， 孙 丽， 蒋碧梅∆， 刘艳娟， 李媛彬， 陈广文， 刘梅冬， 肖献忠

(中南大学湘雅医学院病理生理学系， 湖南 长沙 410078)

目的： 阐明核仁素在小鼠糖尿病性心肌病中的作用。方法: 前期研究中我们采用了心肌特异性过表达核仁素转基因小鼠制备了II型糖尿病性心肌病模型；实验分为野生型对照组、转基因对照组、野生型糖尿病组及转基因糖尿病组。采用麦胚凝集素(wheat germ agglutinin，WGA)荧光染色检测小鼠心肌肥大情况；采用 Masson三色染色检测小鼠纤维化情况；采用PowerLab system检测小鼠心肌功能变化。结果: 与对照组比较，转基因糖尿病组小鼠的血糖值变化不明显，心肌细胞肥大显著减轻， 胶原纤维生成显著减少， 血流动力学指标±dp/dtmax、左室舒张末压、左室峰压和心率均有不同程度的改善，且差异具有统计学意义。结论: 核仁素可能通过减轻糖尿病性心肌病小鼠心肌细胞肥大及纤维化的发生，从而改善糖尿病性心肌病小鼠的心功能。

糖尿病性心肌病； 核仁素； 心肌肥大； 纤维化； 转基因小鼠

糖尿病性心肌病是一种以心肌细胞肥大、间质纤维化、心肌早期舒张功能不全、晚期收缩功能障碍为主要特征表现的特异性心肌病[1-3]。核仁素(nucleolin，C23)是细胞核中含量最丰富的非核糖体穿梭蛋白之一，迄今对其做了大量研究[4]。近年研究表明核仁素作为一种凋亡相关蛋白[5-6]，在心肌内源性保护中也发挥重要的作用[7]。前期研究中，我们采用核仁素转基因(transgenic，TG)小鼠成功构建了小鼠II型糖尿病性心肌病模型并且检测到小鼠心肌中核仁素蛋白表达水平明显升高[8-9]。 然而核仁素是否在糖尿病性心肌病中发挥作用目前尚不清楚，为此我们采用麦胚凝集素(wheat germ agglutinin， WGA)荧光染色、Masson染色及PowerLab system检测等技术，进一步阐明核仁素对糖尿病性心肌病心肌细胞肥大与纤维化以及小鼠心功能改变的影响。

材 料 和 方 法

1 实验动物

实验动物为野生型(wild-type，WT)C57BL/6小鼠，体重22～25 g，雌雄各半，共60只，购自南京大学模式动物研究中心；核仁素过表达转基因小鼠共30只，由南京大学模式动物研究中心构建完成。

2 实验方法

2.1 小鼠II型糖尿病性心肌病模型的制备 将野生型和TG小鼠随机分为对照组和糖尿病模型组，其中模型组给予高脂高糖饲料(20%葡萄糖、2.5%胆固醇、10%猪油和67.5%常规饲料)喂养20周，然后分别于第5、6周将小鼠腹腔注射链脲佐菌素(剂量为60 mg/kg)处理1次；对照组则给予普通饲料喂养并加腹腔注射同等剂量柠檬酸缓冲液处理，保证小鼠在整个实验过程中自由饮食和饮水。

2.2 Western blot检测各组小鼠心肌中核仁素表达水平 分别提取各组小鼠心脏组织中蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，取20 μg蛋白裂解液经12% SDS-PAGE分离，然后采用电转移法将胶上蛋白转移至PVDF膜上，加入封闭液4℃封闭过夜后加入兔nucleolin多克隆抗体(1∶1 000稀释)，于摇床上室温反应2 h。用洗膜液洗3次洗去多余Ⅰ抗，加入辣根过氧化物酶偶联的抗兔IgGⅡ抗(1∶1 000稀释)，于摇床上反应1 h，用洗膜液洗3次洗去多余Ⅱ抗。最后DAB显色后进行灰度扫描机及定量分析。

2.3 RT-PCR 检测 提取各小鼠心肌组织RNA。PCR引物由上海生物工程技术服务有限公司设计并合成。β-肌球蛋白重链(β-myosin heavy chain，β-MHC)上游引物为5′-ATGTGCCGGACCTTGGAA-3′，下游引物为5′-CCTCGGGTTAGCTGAGAGATCA-3′,长度170 bp； GAPDH上游引物为5′-ATGTTCCAGTATGACTCCACTCACG-3′，下游引物为 5′-GAAGACACCAGTAGACTCCACGACA-3′,长度171 bp; collagen 1(Col-1)上游引物为5′-CTGGTCCTGTTGGAAGTCGT-3′，下游引物为 5′-CAGATGCACCTGTTTCTCCA-3′,长度201 bp。以2 μL RNA为模板进行一步法RT-PCR，将PCR产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色后于紫外透射仪下摄像。

2.4 WGA荧光染色 脱蜡同HE染色，抗原修复，80 ℃水浴20 min，冷却，D-Hanks液洗片2次，每次5 min，WGA工作液染色，于室温孵育10 min， 接着D-Hanks洗片3次，每次10 min，甘油封片，最后在荧光显微镜下观察并拍片。

2.5 Masson三色染色 小鼠心肌组织经冰冻切片后，铁苏木素染色 6 min，氨水返蓝，丽春红品红染色液染色 3 min，磷钼酸分化 3 min，苯胺蓝染色 2 min，分化水洗，脱水，透明，中性树脂封片。镜下观察并拍照。胶原纤维染成蓝色，心肌组织染成红色。

2.6 PowerLab system检测小鼠心脏血流动力学 于第20周末，我们将小鼠经腹腔注射10%水合氯醛0.1 mL，待麻醉完全后将其仰卧位固定在动物实验手术台上，行气管切开术，连接小动物呼吸机(其中呼吸频率设置为每分钟90次，潮气量设置为0.6 mL)，接着开胸，暴露心脏视野，将20 mL注射器针头连于PowerLab system 数据采集分析系统传感器，然后于小鼠心尖处进针入左心室，采用血流动力学分析软件监测心功能变化并记录结果。

2.7 染色分析方法 WGA荧光染色心肌细胞面积与Masson三色染色胶原纤维面积采用Image-Pro Plus 6.0软件进行分析。

3 统计学处理

采用SPSS 17.0软件包进行统计分析，计量资料用均数±标准差(mean±SD)表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 核仁素过表达对小鼠血糖的影响

采用心肌特异性过表达小鼠构建糖尿病模型，Western blot结果显示野生型糖尿病组小鼠心肌核仁素蛋白水平较对照组野生型小鼠显著升高，且差异具有统计学意义，但转基因糖尿病组小鼠心肌核仁素蛋白水平与转基因对照组小鼠比较改变不明显，差异无统计学显著性；此外，野生型糖尿病组和转基因糖尿病组空腹血糖值均明显升高，且分别较野生型对照组与转基因对照组增加了58.86%及63.43%。转基因糖尿病组与野生型糖尿病组相比较差异无统计学显著性。上述结果变化说明了小鼠糖尿病模型构建成功，且核仁素过表达并不影响血糖值的改变，见图1。

Figure 1.The protein level of nucleolin (A) and blood glucose (B) in the mice. WT: wild-type mice; TG: nucleolin transgenic mice. Mean±SD.n=5.#P<0.05vsWT mice in control group；*P<0.05vsWT mice in diabetes group.

图1 小鼠心肌核仁素蛋白水平与空腹血糖值的检测

2 核仁素过表达对糖尿病性心肌病小鼠心肌细胞肥大的影响

心肌肥大是糖尿病性心肌病的主要特征之一，我们将各组小鼠心脏切片通过WGA荧光染色后再分别观察各组小鼠心肌细胞的大小。如图2所示，野生型糖尿病组心肌细胞较野生型对照组出现明显肥大，且差异具有统计学意义，而转基因糖尿病组心肌细胞与野生型糖尿病组相比较，心肌细胞肥大明显减轻，2组差异具有统计学意义。

3 核仁素过表达对糖尿病性心肌病小鼠心肌间质纤维化的影响

心肌纤维化是糖尿病性心肌病的另一个主要的病理变化。为了探讨核仁素对糖尿病性心肌病心肌纤维化的影响，我们采用Masson三色染色法观察各组小鼠心肌纤维化程度并统计了胶原纤维的面积。如图3所示，野生型对照组和转基因对照组心肌中可见少量胶原纤维分布，野生型糖尿病组除血管旁胶原累积增多外，心肌间质中也可见大量胶原累积，但转基因糖尿病组较野生型糖尿病组比较，胶原纤维显著减少，经Image-Pro Plus软件分析野生型糖尿病组胶原面积是野生型对照组的11.56倍，转基因糖尿病组胶原面积是野生型糖尿病组的37.4%。

Figure 2.The effect of nucleolin over-expression on cardiac hypertrophy in diabetic mice. A: analysis of cardiomyocyte size by WGA staining (×400)； B: the mRNA expression of β-MHC. Mean±SD.n=5.#P<0.05vswild-type (WT) mice in control group;*P<0.05vsWT mice in diabetes group.

图2 核仁素过表达对糖尿病性心肌病心肌细胞肥大的影响

Figure 3.The effect of nucleolin over-expression on myocardial fibrosis in diabetic mice. A: myocardial interstitial Masson staining (×200); B: the mRNA expression of Col-1. Mean±SD.n=5.#P<0.05vswild-type (WT) mice in control group;*P<0.05vsWT mice in diabetes group.

图3 核仁素过表达对糖尿病性心肌病心肌纤维化的影响

4 核仁素过表达对糖尿病性心肌病小鼠心功能改变的影响

为了进一步确定核仁素过表达对糖尿病性心肌病心功能的保护作用，我们检测了糖尿病性心肌病小鼠相关的心脏血流动力学指标，如图4所示，与野生型对照组小鼠比较，野生型糖尿病组小鼠左心室功能明显降低，其中+dp/dtmax下降了28.2%，-dp/dtmax下降了26.8%，LVEDP升高了2.4倍，LVSP下降了35.9%，心率下降了18.9%，且差异均具有统计学意义；转基因糖尿病组小鼠与野生型糖尿病组小鼠比较其血流动力学指标±dp/dtmax、LVEDP、LVSP和心率均有不同程度的改善，且差异具有统计学意义。

讨 论

糖尿病心肌病是指糖尿病患者心肌细胞原发性损伤引起广泛的结构异常，最终导致左心室肥厚、舒张期和(或)收缩期心脏功能障碍的一种疾病。糖尿病性心肌病的发病机制很复杂，主要包括RASS系统的激活、钙离子交换障碍、糖毒性等，上述原因可引起患者心肌炎症细胞浸润、心肌细胞肥大、心肌纤维化、心肌细胞氧化损伤等一系列改变，从而影响其心肌舒缩功能，最终导致患者因心力衰竭而死亡。糖尿病性心肌病以早期舒张功能障碍，晚期收缩功能障碍为主要特点，为此第20周末我们采用左室导管插入术检测了糖尿病心肌病模型小鼠的血流动力学变化，结果发现，模型小鼠多种心功能指标较正常对照组发生了明显异常。第20周末我们监测了小鼠多种血流动力学指标，结果也表明糖尿病小鼠确实已发生了心功能改变。上述结果也同时表明我们前期研究中构建的II型糖尿病性心肌病小鼠模型是成功的。

作为一种多功能的穿梭蛋白，核仁素可穿梭于细胞核、细胞浆和细胞膜之间，从而发挥其调节机体DNA和RNA代谢等多方面的作用。近年文献报道，核仁素还可介导内皮抑素的抗血管生成、抗肿瘤生物学行为[10-14]，促进早期炎症发生[15]，协助病原微生物(如艾滋病病毒、肝炎病毒)感染[16]，调控神经细胞分化和发育等[17]。

前期研究中我们检测到了糖尿病心肌病模型中野生型糖尿病小鼠心肌中核仁素蛋白水平较对照组出现明显表达上调[8]。然而核仁素蛋白水平改变究竟只是一种伴随现象，还是在糖尿病性心肌病中发挥作用，目前尚不能确定。为此我们采用了心肌特异性核仁素过表达转基因小鼠构建了II型糖尿病性心肌病小鼠模型，然后采用WGA荧光染色Masson三色染色及PowerLab system检测等技术进一步阐明核仁素对糖尿病性心肌病心肌细胞肥大与纤维化以及小鼠心脏血流动力学改变的影响。结果发现与对照组相比较，野生型糖尿病小鼠的心肌明显肥大与纤维化明显减轻，血液动力学指标变化也表明核仁素转基因糖尿病组小鼠心脏功能也有明显改善，这些结果表明在糖尿病性心肌病中，核仁素可能通过减轻小鼠糖尿病所致的心肌肥大及纤维化而改善其心功能。

Figure 4.The effect of nucleolin over-expression on cardiac function alterations in diabetic mice. A: the maximal rate of left ventricular pressure rise (+dp/dtmax); B: the maximal rate of left ventricular pressure drop (-dp/dtmax); C: the left ventricular systolic pressure (LVSP); D: the left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP); E: the heart rate. Mean±SD.n=8.#P<0.05vswild-type (WT) mice in control group;*P<0.05vsWT mice in diabetes group.

图4 核仁素过表达对糖尿病性心肌病小鼠心脏血流动力学改变的影响

近年文献表明，核仁素也是一种RNA结合蛋白，我们前期研究发现核仁素可通过与心肌内源性保护基因的mRNA相结合，从而调控其mRNA的稳定性，进而在心肌保护中发挥作用[7]。然而核仁素是否也可通过调控心肌肥大及纤维化相关基因的mRNA稳定性进而在心肌肥大及纤维化中起作用，目前尚不清楚。TGF-β是纤维化信号通路中主要的细胞因子，有文献报道TGF-β可诱导核仁素蛋白水平显著增加，使其下游促纤维化因子的mRNA稳定性增加，从而促进纤维化的发生[18]。本实验中核仁素过表达可减轻纤维化程度，因此我们推断其机制很可能是核仁素通过调控心肌肥大、纤维化相关基因的mRNA稳定性而发挥作用的，但具体机制还有待进一步的研究证实。综上所述，我们的研究结果为进一步阐明核仁素的心肌内源性保护作用提供了新的线索与思路。

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(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Role of nucleolin on myocardial hypertrophy and fibrosis in type II diabetic cardiomyopathy mice

LÜ Qing-lan, SUN Li, JIANG Bi-mei, LIU Yan-juan, LI Yuan-bin, CHEN Guang-wen, LIU Mei-dong, XIAO Xian-zhong

(DepartmentofPathophysiology,XiangyaSchoolofMedicine,CentralSouthUniversity,Changsha410078,China.E-mail:jiangbimei@163.com)

AIM: To investigate the effect of nucleolin on diabetic cardiomyopathy in mice. METHODS: A type II diabetic cardiomyopathy mouse model was prepared using a cardiac-specific nucleolin-overexpressing transgenic mice. The mice were divided into wild-type mouse control group, nucleolin transgenic mouse control group, wild-type mouse diabetes group and nucleolin transgenic mouse diabetes group. Wheat germ agglutinin (WGA) fluorescent dye, Masson staining and PowerLab system detection were used to further clarify the role of nucleolin on cardiac hypertrophy, fibrosis and cardiac function in type II diabetic cardiomyopathy mice. RESULTS: Compared with wild-type mouse control group, no significant increase in blood glucose level was found, while genetical myocardial cell hypertrophy was significantly attenuated in nucleolin transgenic mouse diabetes group. The collagen fibers were also significantly reduced, and hemodynamic indexes ± dp/dtmax, left ventricular end-diastolic pressure, left ventricular systolic pressure and heart rate were also improved. The above differences were statistically significant.CONCLUSION: Nucleolin may reduce the occurrence of myocardial hypertrophy and fibrosis, thus improving the cardiac function of diabetic cardiomyopathy mice.

Diabetic cardiomyopathy; Nucleolin; Myocardial hypertrophy; Fibrosis; Transgenic mice

1000- 4718(2017)07- 1231- 06

2016- 05- 09

2017- 04- 26

国家自然科学基金资助项目(No. 81170113)

R587.1； R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.013

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者 Tel： 0731-82355022； E-mail： jiangbimei@163.com