辜洪娇， 陈晓华， 孔田玉， 胡 欢， 刘宁宁， 熊旭明， 张振辉△

(广州医科大学附属第二医院1重症医学科，2心血管疾病研究所， 广东 广州 510260)

去泛素化酶USP14调控H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤*

辜洪娇1， 陈晓华1， 孔田玉1， 胡 欢1， 刘宁宁2， 熊旭明1， 张振辉1△

(广州医科大学附属第二医院1重症医学科，2心血管疾病研究所， 广东 广州 510260)

目的： 观察抑制泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)的活性对H2O2诱导的H9c2细胞氧化应激损伤的影响。方法: 体外培养 H9c2 心肌细胞，用H2O2(25 μmol/L)处理2 h，建立心肌细胞氧化应激损伤模型。将细胞分为对照(control，CON)组、模型组(H2O2组)、USP14抑制剂IU1处理组(IU1组)和IU1处理后建模组(IU1+H2O2组)。MTS法检测 H9c2心肌细胞活力；流式细胞术检测细胞内活性氧簇(ROS)的产生和细胞存活率；Western blot法检测丝裂原活化蛋白激酶家族相关蛋白的表达变化。结果: 与CON组相比，H2O2组细胞活力、细胞存活率显著降低，细胞内ROS含量、Bax/Bcl-2、P53、p-ERK1/2、p-JNK和p-P38的蛋白水平显著增加(P<0.05)；与H2O2组比较，IU1+H2O2组细胞活力、细胞存活率显著增加，细胞内ROS含量、Bax/Bcl-2、P53、p-ERK1/2、p-JNK和p-P38蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论: 抑制USP14活性可以减轻氧化应激条件下H9c2 心肌细胞的损伤，其机制可能与抑制丝裂原活化蛋白激酶信号活化和下调凋亡相关蛋白有关。

泛素特异性蛋白酶14； IU1； 氧化应激； 细胞凋亡； 丝裂原活化蛋白激酶

心肌急性缺血、缺氧、再灌注等异常可导致心肌的急性损伤，从而引起许多心血管疾病如充血性心力衰竭、心肌梗死、心肌病等的发生，其中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)介导的氧化应激损伤是这些疾病发生过程中重要的参与者[1]。体内ROS增多可诱导心肌细胞坏死或者凋亡，因此，如何减轻心肌细胞在氧化应激中的急性损害一直是当前研究者关注的重点之一。

去泛素化酶(deubiquitinating enzyme，DUB)作为泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system，UPS)的重要组成成分，可调节靶蛋白泛素化进程，参与肿瘤与癌症[2]、代谢与应激[3]、感染与免疫[4]、干细胞与发育调控[5]等体内相关病理生理过程。泛素特异性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)是一种重要的去泛素化酶，参与人体内多种蛋白质的降解及多种信号通路的调控[6]。有研究发现，用USP14的选择性抑制剂IU1抑制USP14活性后，可能通过降低糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthasc kinase-3β，GSK-3β)的磷酸化水平发挥抗心肌肥厚的作用[7]。促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是心肌细胞中一个重要的信号转导通路，参与介导心肌细胞增殖、分化及凋亡等多个生物学过程。USP14对急性心肌氧化损伤的生物学作用目前尚不清楚，本研究用不同浓度的IU1预处理H9c2心肌细胞，探讨抑制USP14活性是否减轻过氧化氢(hydrogen peroxide，H2O2)诱导的H9c2心肌细胞急性损伤，其作用机制是否与MAPK信号通路(P38、JNK和ERK1/2)和凋亡相关蛋白 Bax、Bcl-2、P53的变化相关。

材 料 和 方 法

1 材料

大鼠H9c2心肌细胞购自上海细胞库；高糖DMEM 培养基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Gibco；MTS检测试剂盒购于Promega；活性氧、凋亡等检测试剂盒购自凯基公司；IU1、H2O2购自Sigma；抗p-P38、p-JNK、p-ERK1/2、Bax、Bcl-2、P53等抗体均购自Cell Signaling Technology。取大鼠H9c2心肌细胞，用含10%胎牛血清的 DMEM完全培养液在37 ℃、5% CO2、95%饱和湿度条件下培养。

2 方法

2.1 细胞活力的检测 取H9c2细胞，接种于96孔细胞培养板(每孔细胞数为1×105)，培养24 h后，将细胞分为：对照(control，CON)组、H2O2(25 μmol/L)处理组、IU1(25 μmol/L、50 μmol/L)处理组和IU1预处理后加H2O2组(IU1+H2O2组)，每组至少3个复孔。H2O2作用2 h后，每孔培养板加入MTS试剂20 μL，继续培养3 h，在酶标仪490 nm波长处读取吸光度(A)值。设对照组为100%，计算其余各组与对照组的比值。

2.2 细胞存活率的检测 取对数生长期H9c2细胞，接种于6孔板，待细胞生长至85%融合状态时按上述分组处理、收集细胞，用预冷的PBS 洗涤2次。按凯基凋亡检测试剂盒中说明书处理细胞后上机检测，计算各组细胞存活率。

2.3 ROS水平的检测 取对数生长期的细胞，0.25%胰酶消化，接种于6孔板，待细胞贴壁后按以上分组方法处理细胞，PBS 洗涤1 次，根据凯基活性氧检测试剂盒说明书提示处理细胞，以激发波长488 nm、发射波长525 nm上机检测各组细胞的荧光强度。

2.4 不同浓度的H2O2作用后USP14蛋白的检测 取对数生长期H9c2细胞，接种于6孔板，培养24 h待细胞生长至85%融合状态，将细胞分为对照组、不同浓度(25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L)H2O2处理组。分组处理2 h后，裂解细胞，提取总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度，蛋白经12%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后转至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温封闭， USP 14 I 抗4 ℃孵育过夜，洗膜3次，II 抗室温孵育1 h，PBST洗膜后用增强化学发光试剂盒显色，以GAPDH 作为内参照蛋白。

2.5 Bax、Bcl-2、P53及MAPK通路相关蛋白的检测 H9c2 细胞分组同2.1。Western blot步骤与USP14检测步骤一致。

3 统计学处理

运用软件SPSS 16.0进行统计学分析，数据以均数±标准差(mean±SD)表示，2组间差异采用t检验，多组间差异采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 抑制USP14活性可降低由H2O2诱导的H9c2细胞损伤

如图1所示，H2O2(25 μmol/L)处理2 h后，心肌细胞活力显著低于CON组(P<0.05)；IU1(25、50 μmol/L)+H2O2处理组的细胞存活率较H2O2处理组明显升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)；而IU1单独处理组与CON组比较，细胞活力无明显变化。

2 抑制USP14活性可增加H2O2诱导的H9c2细胞存活率

如图2所示，细胞存活率为第3象限细胞所占比值。25 μmol/L H2O2作用于大鼠心肌细胞2 h后，其存活率明显低于CON组(P<0.05)；与H2O2组相比，IU1(25 μmol/L、50 μmol/L)+H2O2处理组存活率明显升高(P<0.05)。

Figure 1.The changes of the viability of H9c2 cells induced by H2O2and/or IU1. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsH2O2group.

图1 不同浓度IU1作用对H2O2诱导的H9c2心肌细胞活力的影响

Figure 2.The effect of IU1 at different concentrations on the survival rate of H2O2-induced H9c2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsH2O2group.

图2 不同浓度IU1对H2O2诱导的H9c2心肌细胞存活率的影响

3 抑制USP14活性可降低H2O2诱导的H9c2细胞内ROS水平

图3显示，与CON组相比，H2O2组的平均荧光强度明显升高(P<0.05)；与H2O2组相比，IU1+H2O2处理组细胞的平均荧光强度显著降低(P<0.05)，即心肌细胞内的ROS水平显著降低。

Figure 3.The effect of IU1 at different concentrations on the intracellular ROS expression in H2O2-induced H9c2 cells. MFI： mean fluuoreacence intensity. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsH2O2group.

图3 不同浓度IU1作用对H2O2诱导的H9c2心肌细胞内ROS水平的影响

4 不同浓度H2O2作用H9c2细胞后USP14蛋白的表达变化

图4结果显示，不同浓度H2O2(25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L)处理2 h后，H9c2心肌细胞的USP14蛋白表达与CON组相比，差异无统计学显著性。

Figure 4.The effects of H2O2at different concentrations on the expression of USP14 in the H9c2 cells. Mean±SD.n=5.

图4 不同浓度H2O2作用H9c2细胞后USP14的表达

5 抑制USP14活性可降低H2O2诱导的H9c2 细胞中Bcl-2、Bax 和P53蛋白的表达

图5结果显示，与CON组相比，H2O2组的凋亡蛋白Bax/Bcl-2比值和P53的蛋白表达增加，差异有统计学意义(P<0.05)；IU1+H2O2处理组与H2O2组相比，Bax/Bcl-2比值和P53的蛋白表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

6 抑制USP14活性对p-ERK1/2、p-JNK和p-P38水平的影响

如图5所示，与CON组相比，H2O2组的p-ERK1/2、p-JNK和p-P38蛋白水平增加，差异有统计学意义(P<0.05)，而IU1+H2O2处理组与H2O2组相比p-ERK1/2、p-JNK和p-P38的蛋白水平降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

Figure 5.The effect of IU1 at different concentrations on the protein expression in H2O2-induced H9c2 cells. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCON group;#P<0.05vsH2O2group.

图5 不同浓度IU1作用对H2O2诱导的H9c2心肌细胞内相关蛋白水平的影响

讨 论

氧化应激诱导的心肌细胞凋亡是急性心肌损伤的主要病理机制之一。正常的生理情况下，H2O2作为ROS的成分之一，参与体内基因表达调控、细胞增殖和凋亡等许多重要的细胞过程，过量的ROS可直接发挥细胞毒性作用损伤细胞[8]。

许多研究已证实在结直肠癌、上皮性卵巢癌、多发性骨髓瘤、肝内胆管癌等肿瘤中均有USP14高表达的现象，USP14可能在肿瘤的进展和转移中具有明显促进作用[9-10]。然而有研究表明，某些DUBs在凋亡的调控中具有促进凋亡和抑制凋亡的双重复杂作用，USP14作为一种重要的去泛素化酶，可以通过调节靶蛋白的稳定性来影响蛋白的功能(其靶蛋白包括转录因子、信号转导分子以及酶等)，同时也可以通过调节如NF-κB、MLK3、Wnt、UPR等多种相关信号通路，参与调控细胞周期、凋亡、DNA损伤等细胞生物学过程[11-12]。USP14在凋亡过程的调控中可能具有促进或抑制凋亡的双重作用，而USP14行使相关功能也可能与细胞所处的环境有关。

本研究中使用不同浓度的H2O2作用H9c2细胞后USP14蛋白的表达与正常细胞相比，并无明显差异，但抑制USP14活性能显著改善H2O2对心肌细胞的损伤。为进一步探讨去泛素化酶USP14调控心肌细胞抗氧化损伤的机制，本实验采用不同浓度(25 μmol/L、50 μmol/L)的IU1抑制USP14活性，观察H9c2细胞内增殖、凋亡及MAPKs通路的变化情况。

MAPKs是心肌细胞中一个重要的信号转导通路，起着整合胞内信号，并将胞浆信号与表达程序偶联在一起的作用，参与介导心肌细胞增殖、分化、转化及凋亡等多个生物学过程。其主要有3个亚族，P38 MAPK、JNK/SAPK以及ERK1/2。总体上说，ERK1/2主要由生长因子活化，对细胞的增殖和存活起着重要的作用，P38和JNK通路可诱导细胞凋亡。然而，有研究表明，不同的细胞中这些通路作用的机制更为复杂[13]。某些情况下，P38 和JNK短暂的活化可提供一个生存信号，而持续的活化则可诱导细胞凋亡，这些信号通路的平衡共同决定细胞的生存或死亡。我们在上述研究中发现，心肌细胞受到氧化应激损伤时，可能同时激活MAPK通路的3个亚族，通过特异性拮抗USP14的活性，对这3个亚族均有抑制作用，但具体的机制并不清楚，仍需进一步探讨。

在心肌细胞凋亡过程中，线粒体起关键作用，Bcl-2 家族中的抗凋亡蛋白Bcl-2与促凋亡蛋白Bax比值变化可直接影响线粒体膜的极性，经过一系列反应，最终激活细胞调亡。抑癌基因p53在正常细胞中表达水平很低，在缺血、缺氧损伤中，P53表达增加，ROS合成增加，形成氧化应激，从而破坏线粒体的氧化磷酸化[14]。在某些类型的细胞中，P53蛋白可直接激活Bcl-2家族基因表达而诱导细胞凋亡[15]。本实验发现,与正常细胞相比，H2O2处理细胞存活率显著下降，而P38、JNK和ERK1/2磷酸化水平均显著升高，同时P53、Bax和细胞内ROS含量显著升高，Bcl-2表达下降；用IU1抑制USP14活性后，细胞存活率显著升高，P38、JNK和ERK1/2的磷酸化水平明显降低，同时P53、Bax和细胞内的ROS含量显著下降，Bcl-2表达升高。

综上所述，抑制去泛素化酶USP14的活性可在体外较好的抗氧化损伤所导致的心肌细胞凋亡，其机制可能与抑制ERK1/2、JNK/SAPK及P38 MAPK信号通路活化、下调凋亡蛋白P53和Bax、上调抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关。

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(责任编辑： 林白霜， 余小慧)

USP14 regulates H2O2induced oxidative stress in H9c2 cells

GU Hong-jiao1, CHEN Xiao-hua1, KONG Tian-yu1, HU Huan1, LIU Ning-ning2, XIONG Xu-ming1, ZHANG Zhen-hui1

(1DepartmentofCriticalCareMedicine，2GuangzhouInstituteofCardiovascularDisease,TheSecondAffiliatedHospitalofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou510260,China.E-mail:drzhzhh@126.com)

AIM: To evaluate the effect of inhibiting ubiquitin-specific protease 14 (USPl4) activity on oxidative stress induced by H2O2of H9c2 cells. METHODS: The H9c2 cells were incubated with H2O2at 25 μmol/L for 2 h to establish the oxidative stress injury model. The cells were divided into control group, H2O2group, IU1 group (25 μmol/L or 50 μmol/L) and IU1+ H2O2group. The H9c2 cells activity was measured by MTS assay. The level of intracellular reactive oxygen species (ROS) and cell survival rate were analyzed by flow cytometry assay. The changes of the mitogen-activated protein kinase (MAPK) family related proteins were detected by Western blot. RESULTS: Compared with control group, the cell activity and the viability rate in H2O2group were decreased (P<0.05), while the intracellular ROS, the protein levels of Bax/Bcl-2, P53, p-ERK1/2, p-JNK and p-P38 were increased (P<0.05). Compared with H2O2group, the cell activity and the viability rate of the H9c2 cells in IU1+H2O2group were increased (P<0.05), while the intracellular ROS, the protein levels of Bax/Bcl-2, P53, p-ERK1/2, p-JNK and p-P38 were decreased (P<0.05). CONCLUSION: Inhibition of USPl4 activity reduces the oxidative stress injury of the H9c2 cells. The mechanism may be related to inhibition of the MAPK signaling and down-regulation of apoptosis related proteins.

Ubiquitin-specific protease 14; IU1; Oxidative stress; Apoptosis; Mitogen-activated protein kinase

1000- 4718(2017)07- 1209- 05

2016- 11- 03

2017- 03- 17

国家自然科学基金青年项目(No. 81201453；No. 81400231)；广东省自然科学基金资助项目(No. S2013010014887)；广东省科技计划项目(No. 2014A020212330)；广州市珠江科技新星专项(No. 201506010071)

R541； R363.1+4

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.009

杂志网址： http://www.cjpp.net

△通讯作者Tel: 020-34153241； E-mail: drzhzhh@126.com