孙瑞丽，朱淑霞，张燕燕，王行健

(滨州医学院附属医院儿科，山东 滨州 256600)

[专题研究]

异甘草素对小儿脑胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响及相关机制研究

孙瑞丽，朱淑霞，张燕燕，王行健

(滨州医学院附属医院儿科，山东 滨州 256600)

目的 研究异甘草素对脑胶质瘤U251细胞增殖、凋亡的影响，并探讨其相关分子机制。方法 取对数生长期人脑胶质瘤U251细胞，用不同浓度(0、10、20、40、60、80μmol/L)异甘草素处理，每个浓度设5个复孔。异甘草素处理24h、48h、72h后，采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力，采用流式细胞术检测细胞凋亡的变化，逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测FoxM1 mRNA的表达水平。结果 U251细胞经过浓度为0、10、20、40、60、80μmol/L的异甘草素处理24h、48h及72h后，细胞增殖均不同程度地受到抑制。在相同作用时间，不同浓度之间细胞增殖情况比较差异有统计学意义(F值分别为38.5、98.9、108.1，均P<0.05)；在相同异甘草素浓度，不同作用时间(24h、48h、72h)细胞增殖情况比较差异均有统计学意义(F值分别为11.4、20.8、43.1、53.9、30.4，均P<0.05)。不同浓度异甘草素作用于U251 细胞24h后，随着异甘草素浓度的增加，细胞凋亡率增加(F=120.3，P<0.05)。不同浓度异甘草素处理U251细胞48h后，FoxM1 mRNA相对表达量分别为(71.2±5.1)%、(54.6±3.3)%、(35.4±4.1)%、(20.8±4.0)%，比较差异有统计学意义(F=83.5，P<0.05)。结论 异甘草素体外可有效抑制U251细胞的增殖并诱导其凋亡，其分子机制可能与下FoxM1基因的表达有关。

异甘草素；脑胶质瘤；增殖；凋亡；FoxM1

脑胶质瘤是小儿颅内最常见的原发性神经系统肿瘤，具有恶性程度高、生长增殖快、生存期短等特点，严重危害患儿身体健康。目前其常规治疗以手术治疗为主、放化疗为辅。但因脑胶质瘤病理类型复杂，浸润范围广，与正常组织分界不清，目前手术切除困难，其复发率也较高；另外胶质瘤对放射线敏感性较低，且传统的化疗药物在杀伤胶质瘤细胞的同时又对人体正常细胞产生较强的毒副作用，且易出现多药耐药，容易导致化疗失败。中药治疗毒性低、疗效好，且能与其他化疗药物配伍使用，具有广阔的应用前景。异甘草素(Lsoliquiritigenin，ISL)是一种从甘草和葱中提取的具有查耳酮结构的甘草黄酮类化合物，具有广泛的生物和药理活性, 具有抗氧化[1]、抗肿瘤[2]，逆转耐药[3]、保护心血管[4]等属性，其抗肿瘤作用是近年来的研究热点。有研究证实，ISL能抑制人类前列腺癌[5]、肺癌[6]、白血病[1]及乳腺癌[2]等多种癌细胞的增殖，并诱导细胞凋亡，但对脑胶质瘤细胞的影响较少报道。本试验初步观察 ISL对人脑胶质瘤细胞U251增殖与凋亡的影响，探讨其可能的分子机制，为其临床应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料与试剂

人脑胶质瘤细胞株U251(武汉博士德生物技术有限公司)，异甘草素(大连美仑生物技术有限公司)，RPMI1640 培养基、胎牛血清(美国 Hyclone 公司)；总RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、PCR反应试剂盒(日本 TAKARA 公司)；四甲基偶氮唑[3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT](碧云天生物技术有限公司)；流式细胞凋亡试剂盒(BD公司)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司)；PCR引物(生工生物工程上海有限公司)。

1.2方法

1.2.1细胞培养

将U251细胞株置于含10%胎牛血清及含青霉素(浓度为100U/mL)、链霉素(浓度为0.1mg/mL)双抗的RPMI1640培养基中培养，在37℃、5%CO2培养箱中培养，2～3天传代1次。

1.2.2四甲基偶氮唑法检测细胞增殖能力

取对数生长期U251细胞，调整细胞密度为2.5×104/mL，每孔100μL接种于96孔板上。待细胞贴壁后，每组分别加入ISL，使其终浓度分别为0、10、20、40、60、80μmol/L。将各组细胞置于37℃、5%CO2培养箱中分别培养24h、48h及72h后，每孔加入20μL(5mg/mL)MTT孵育4h，弃去培养基，加入150μL DMSO溶解结晶，用酶标仪测定每孔在490nm处的吸光度值(A490)。实验重复3次。计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率(IR)=(1-实验组A490/空白组A490)×100%。

1.2.3细胞凋亡的检测

取对数生长期 U251细胞，调整细胞密度2×105/孔接种于6孔板上，培养基终体积2.5mL，培养24h后收集细胞，后用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗涤2次(780g离心5min)后弃上清，依次加入500μL结合缓冲液(binding buffer)悬浮细胞、5μL磷脂酰丝氨酸蛋白抗体-异硫氰酸酯(Annexin V-FITC)、5μL碘化丙啶(propidium iodide，PI)混匀，室温避光反应15min，1h内上流式细胞仪检测。实验重复3 次。

1.2.4逆转录-聚合酶链反应法检测FoxM1 mRNA的表达

取对数生长期U251细胞接种于6孔板上，调整细胞密度为2×105个/孔，加入不同浓度(0、20、40、60μmol/L)异甘草素。分别于加药48h后收集细胞，并提取细胞总RNA，测定RNA纯度，A260/A280 =1.8～2.0，测定RNA浓度。逆转录-聚合酶链反应(reverse transcriotion-polymerase chain reaction，RT-PCR)两步法检测FoxM1 mRNA的表达情况，β-actin为内参，引物序列为：正义链5′-TCAGGG￣ATGGTGAGAGATCC-3′，反义链 5′-GAATGGG￣CAAACCTTCA￣GTC-3′。FoxM1正义链5′-TGCAGCTA￣GGATTGAATCTTC-3′，反义链5′-GGAGCCCAGT￣CCATC￣AGAACT-3′。按下列条件进行RT-PCR反应：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火45s，72℃延伸30s，总共进行35个循环；最后72℃延伸10min。实验重复3次。

1.3统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件进行分析。数据以“均数±标准差”表示，多组比较采用One-way ANOVA方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1异甘草素对U251细胞增殖的影响

U251细胞经0、10、20、40、60、80μmol/L的异甘草素处理24h、48h及72h后，细胞增殖均不同程度地受到抑制。在相同作用时间，不同浓度之间细胞增殖情况比较差异有统计学意义(F值分别为38.5、98.9、108.1，均P<0.05)；在相同异甘草素浓度，不同作用时间(24h、48h、72h)细胞增殖情况比较差异均有统计学意义(F值分别为11.4、20.8、43.1、53.9、30.4，均P<0.05)。24h、48h、72h的半数抑制浓度(IC50)值逐渐缩小，分别(50.5±4.3)、(38.9±0.8)、(22.3±0.6)μmol/L。依据以上结果，筛选20、40、60μmol/L的异甘草素用于后续试验。不同浓度的异甘草素对U251细胞增殖抑制的影响见图1。

图 1 MTT法检测不同浓度的异甘草素作用不同时间后人脑胶质瘤细胞株U251 细胞的增殖抑制率

Fig. 1 Proliferation inhibitory rates of U251 cells treated with ISL of different concentration (0, 10, 20, 40, 60, 80μmol/L) for different time detected by MTT

2.2异甘草素对 U251细胞凋亡的影响

不同浓度异甘草素(0、20、40、60μmol/L)作用于U251细胞24h后，AnnexinV-FITC/PI 染色双法检测细胞凋亡，凋亡率分别为(3.2±0.6)%、(8.7±1.9)%、(19.3±2.5)%、(37.8±3.6)%，随着药物浓度的增加凋亡率增加，差异有统计学意义(F=120.3，P<0.05)，见图2。

注：A为异甘草素0μmol/L，B 为异甘草素20μmol/L，C为异甘草素40μmol/L，D为异甘草素60μmol/L；随着异甘草素浓度的增加，U251细胞凋亡率增加；凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率=右下象限+右上象限。

图 2 不同浓度异甘草素作用24h 对U251 细胞凋亡的影响

Fig. 2 Effect of ISL of different concentration on cell apoptosis of U251 cells at 24h

2.3异甘草素对U251细胞FoxM1基因表达的变化

通过分析实时荧光定量PCR法检测FoxM1 mRNA的表达结果显示，不同浓度的异甘草素(0、20、40、60μmol/L)处理U251细胞48h后，FoxM1 mRNA相对表达量分别为(71.2±5.1)%、(54.6±3.3)%、(35.4±4.1)%、(20.8±4.0)%，比较差异有统计学意义(F=83.5，P<0.05)，见图3。

图 3 不同浓度异甘草素作用48h对U251细胞FoxM1 mRNA基因表达的影响

Fig. 3 Effect of ISL of different concentration on expression of FoxM1 mRNA of U251 cells at 48h

3讨论

3.1儿童脑胶质瘤的临床特征及传统治疗的局限性

胶质瘤是儿童中枢神经系统最常见的肿瘤，发病率为2.0/10万，发病高峰年龄为5～8岁，学龄前后发病较多，且统计发现男孩多于女孩，比例约为1.3:1，该病具有发病率高、致死率高、复发率高及生存期短等特点[7]。胶质瘤的临床症状主要包括颅内压增高及肿瘤压迫两方面，如头围增大、头痛、呕吐、视物模糊、行走不稳、生长发育异常及局限性癫痫，后期表现为神经方面功能缺失，如瘫痪等[8]。脑胶质瘤常规治疗包括手术切除、放疗及化疗。手术切除是其主要治疗手段，但因儿童胶质瘤位于中线部位居多，手术入路困难，术后并发症多且严重。另外，放疗对小儿正在发育的神经系统有难以预测的影响，所以有些待3岁后才能放疗，因而化疗逐渐成为治疗儿童胶质瘤的重要手段。目前，主要的化疗药物包括替莫唑胺、顺铂及甲氨蝶呤，但化疗药物毒副作用大且易产生耐药，复发率极高，平均生存时间仍小于14个月。因此从天然药物中寻找新的低毒、高效的靶向基因治疗抗肿瘤药物，是目前国内外专家学者亟待解决的重要问题。

3.2异甘草素抑制U251细胞增殖，促进细胞凋亡

中国传统医药在临床上的应用历史悠久，博大精深。异甘草素属于黄酮类化合物，广泛存在于甘草等植物中，具有广泛的生化学特性。近年来，异甘草素对前列腺癌、肺癌、乳腺癌等多种肿瘤具有抑制作用，其抗肿瘤作用逐渐被重视。为了探讨异甘草素是否抑制脑胶质瘤细胞生长及促进凋亡，本研究以U251细胞为研究对象进行试验。结果显示，U251细胞经浓度为 0、10、20、40、60、80μmol/L的异甘草素处理24h、48h及72h后，细胞增殖均不同程度地受到抑制，呈显著的剂量及时间依赖性。不同浓度异甘草素(0、20、40、60μmol/L)作用于U251细胞24h后，Annexin V-FITC/PI双染色法检测U251细胞凋亡结果显示，随着异甘草素浓度的增加，细胞凋亡率增加。提示异甘草素能通过抑制U251细胞增殖、诱导细胞凋亡发挥抗脑胶质瘤的作用。

3.3异甘草素抗肿瘤作用机制

多种基因参与脑胶质瘤的发生和发展。叉头框转录基因M1(forkhead box M1，FoxM1)是转录因子家族成员之一，该转录因子的作用涉及广泛的生物学过程，包括细胞增殖、分化，细胞周期及凋亡、损伤修复等，其表达失调在胃癌、宫颈癌等多种肿瘤的发生及发展中发挥着重要作用[9-10]。因此，FoxM1在多种肿瘤中被认为是重要的分子标志与治疗的潜在靶标，然而在脑胶质瘤作用的研究报道少见。Liu等[11]研究了FoxM1表达水平与急性粒细胞白血病(myeloid leukemia，AML)患者的临床特点及预后的相关性，发现FoxM1基因高表达与白血病危险程度有关，且提示预后不良，因此FoxM1有望成为一个有前途的治疗靶点及潜在的预后标志。颜世举等[12]研究表明FoxM1过表达能导致骨肉瘤的发生，沉默FoxM1 mRNA 基因的表达能够显著抑制骨肉瘤细胞的增殖，从而促进凋亡。本试验通过RT-PCR法检测FoxM1 mRNA的表达，结果显示，不同浓度的异甘草素(0、20、40、60μmol/L)处理U251细胞48h后，随着异甘草素浓度增加，U251细胞中FoxM1 mRNA表达水平逐渐下降，提示异甘草素可能通过下调FoxM1 mRNA基因的表达，发挥其抗脑胶质瘤的作用，其治疗作用是否与FoxM1 mRNA基因有关还有待于进一步研究。

综上所述，本研究证实异甘草素显著抑制U251细胞增殖并诱导其凋亡，其相关机制可能与下调FoxM1基因的表达有关。本试验初步证明了异甘草素的抗脑胶质瘤作用，为异甘草素应用于脑胶质瘤的治疗提供了理论依据。

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[专业责任编辑:孙 新]

Effects of isoliquiritigenin on proliferation and apoptosis in children glioma cells and its possible mechanisms

SUN Rui-li, ZHU Shu-xia, ZHANG Yan-yan, WANG Xing-jian

(Department of Pediatrics, Affiliated Hospital of Binzhou Medical University, Shandong Binzhou 256600, China)

Objective To study the influence of isoliquiritigenin (ISL) on U251 cell proliferation and apoptosis and its relevant molecular mechanisms. Methods U251 cells in logarithmic phase were extracted and cultured with different concentration of ISL (0, 10, 20, 40, 60, 80μmol/L), and every concentration was provided with 5 holes. Cell proliferation was detected by methyl thiazolyl tetrazolium (MTT) and cell apoptosis was measured by flow cytometry after treatment for 24h, 48h and 72h. Expression level of FoxM1 mRNA was determinated by reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Results Proliferation of U251 cell was inhibited at different degree at 24h, 48h or 72h after being disposed in ISL with concentration of 0, 10, 20, 40, 60, 80μmol/L. Difference in cell proliferation in different concentration of ISL for same action time had statistical significance (Fvalue was 38.5, 98.9 and 108.1, respectively, allP<0.05). Difference in cell proliferation in same concentration of ISL for different action time (24h, 48h, 72h) was statistically significant (Fvalue was 11.4, 20.8, 43.1, 53.9 and 30.4, respectively, allP<0.05). After U251 cells were disposed in different concentration of ISL for 24 hours, cell apoptosis rate increased with increase of ISL concentration (F=120.3,P<0.05). FoxM1 mRNA expression level was 71.2±5.1%, 54.6±3.3%, 35.4±4.1% and 20.8±4.0%, respectively when U251 cell disposed in different concentration of ISL for 48h, and difference was statistically significant (F=83.5,P<0.05). Conclusion ISL could inhibit proliferation and induce apoptosis of U251 cells in vitro. Its molecular mechanism is related with down-regulation of FoxM1 expression.

isoliquiritigenin (ISL); brain glioma; proliferation; apoptosis; FoxM1

2017-02-19

滨州市软科学资助项目(2016BRK18)

孙瑞丽(1990-)，女，在读硕士研究生，主要从事儿童神经系统疾病的研究。

朱淑霞，副主任医师。

10.3969/j.issn.1673-5293.2017.06.002

R739.4

A

1673-5293(2017)06-0624-03