周懂晶，刘玉品，陈志远，汪印强，冉鹏程，易华

（1.广州中医药大学第二临床医学院影像科，广东广州510120；2.广州中医药大学病理教研室，广东广州510120）

3.0 T BOLD-fMRI评价灯盏花素对大鼠对比剂急性肾损害的抵制作用

周懂晶1，刘玉品1，陈志远1，汪印强1，冉鹏程1，易华2

（1.广州中医药大学第二临床医学院影像科，广东广州510120；2.广州中医药大学病理教研室，广东广州510120）

目的：应用3.0 T BOLD-fMRI评估灯盏花素对大鼠对比剂急性肾损害（CI-AKI）的抵制作用。方法：将60只SD大鼠随机分为灯盏花素组和对照组各30只，灯盏花素组于注射对比剂前后连续注射灯盏花素注射液7 d（1次/d），对照组于注射对比剂前后连续注射生理盐水7 d。2组于注射对比剂前及注射对比剂后20min、24h、48h、72h和7 d共6个时间点行3.0 T BOLD-fMRI扫描，测量大鼠肾脏外髓部R2*值，取大鼠肾脏病理检查，HE染色后评价外髓部肾小管损伤情况，分析比较2组R2*值及病理损伤变化。结果：灯盏花素组注射对比剂20min后R2*值持续升高至24 h，48 h回落直至7 d时；对照组注射对比剂20min后R2*值升高，持续至72 h，7 d后回落至注射对比剂前。注射对比剂后48、72 h灯盏花素组与对照组R2*值比较差异均有统计学意义（均P＜0.05），余时间点2组R2*值比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。病理结果表明，对照组注射对比剂后20min肾脏外髓部肾小管出现损伤，24～48 h损伤减轻，72 h损伤又加重，但低于20min时，7 d后损伤加重，接近20min组；灯盏花素组注射对比剂后20min肾脏外髓部肾小管损伤严重，24～48 h损伤减轻，渐低于对照组损伤程度，72 h损伤又加重，但低于对照组，7 d后损伤减轻。注射对比剂后，24 h时2组损伤差异无统计学意义（P＞0.05），余时间点2组差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论：3.0 T BOLD-fMRI可评估CI-AKI引起的肾髓质氧含量的变化，提供定量的R2*值，在一定程度上反映灯盏花素注射液对大鼠CI-AKI的早期保护作用。

磁共振成像；灯盏花素；对比剂急性肾损害；大鼠

对比剂急性肾损害（contrast-induced acute kidney injury，CI-AKI）是指对比剂血管内给药后48～72 h内出现、无其他原因的急性肾功能损害性疾病，以血清肌酐较基础水平升高25%或绝对值升高0.5mg/dL为诊断标准［1］。自对比剂应用于医学成像以来，因其引起的医源性急性肾功能损害也越来越受到关注，目前已成为医源性急性肾功能衰竭的主要原因之一，占急性肾功能衰竭的10%［2-4］。灯盏花素是从菊科飞蓬植物灯盏细辛中提取的黄酮类成分，主要含灯盏乙素（4，5，6-三羟基黄酮-7葡萄糖醛酸甘）。近年来研究证明，灯盏花素能抑制血小板聚集，改善微循环障碍，降低血液黏滞度，增加肾血流量，降低肾小球内血液高凝状态，最终起到保护肾脏的作用［5-6］。但目前应用3.0 T BOLD-fMRI探讨灯盏花素防治CI-AKI作用机制的报道较少，为此本研究探讨灯盏花素早期改善CI-AKI方面作用，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 一般材料60只雄性SD大鼠，体质量260～320 g，随机分为灯盏花素组和对照组各30只。MRI扫描前4 h所有大鼠禁食不禁水，2%戊巴比妥钠（剂量0.3mL/100 g体质量）腹腔麻醉后10～20min行MRI检查。实验动物经广州中医药大学第二临床医学院动物伦理委员会审议通过，符合实验动物伦理福利原则。

1.2 仪器与方法使用GE 3.0 T Signa/Excite MRI扫描仪，50mm Birdcage动物实验专用线圈。大鼠取仰卧位，头先进，腹部位于线圈中央。MRI扫描序列：横断位及冠状位T1WI FSE-XL/90 TR 500 ms，TE 13.3ms，带宽15.6 kHz，FOV 10.0 cm×7.0 cm，层厚2.0mm，层距0.20mm，层数8层，矩阵288×192，NEX 4.0。T2WI FSE-XL/90 TR 3500ms，TE 125.8ms，带宽62.5 kHz，FOV 10.0 cm×7.5 cm，层厚2.0mm，层距0.20 mm，层数8层，矩阵288×192，NEX 6.0。BOLD-fMRI扫描序列：多次快速梯度回波（MFGRE）序列：冠状位，TR 100ms，TE 4.0ms，带宽31.3 kHz，FOV 10.0 cm×10.0 cm，层厚2.2mm，层距0.20mm，矩阵96×96，NEX 8.0。所有大鼠剂量按0.6mL/100 g体质量经尾静脉注射对比剂碘帕醇（370mgI/mL），注射对比剂前及注射对比剂后2～7 d，2组大鼠分别给予尾静脉注射灯盏花素注射液（湖南恒生制药股份有限公司）和生理盐水，1次/d（剂量0.625mL/100 g体质量）。于注射对比剂前、注射后20min、24 h、48 h、72 h及7 d每组各5只大鼠行MRI扫描，扫描结束后过量麻醉处死大鼠取双肾行病理检查。

1.3 BOLD-fMRI图像处理与数据分析使用GE ADW 4.3工作站functool软件进行图像分析及数据处理。每只大鼠每侧肾脏测量外髓部T2*值。R2*值通过公式R2*=1/T2*计算得到，R2*值增加提示脱氧血红蛋白浓度升高，组织氧分压降低。在皮髓质分界清晰的层面，采用手绘法放置ROI，同一肾脏测量ROI大小、形状完全一致，大小为1.5～2.5mm2，至少包含5个像素，避开肉眼所见大血管及伪影，尽可能减少噪声及部分容积效应的影响。测量每个肾脏的外髓3个ROI，取平均值。所有数值均由同一人测量。

1.4 大鼠肾脏外髓肾小管病理损伤评分制备肾脏冠状面HE染色切片，参照Paller等［7］的病理评分标准：①肾小管明显扩张，细胞扁平为1分；②刷状缘损伤为1分，脱落为2分；③细胞膜大泡为1分，细胞浆空泡为1分；④间质水肿为1分；⑤肾小管腔内有脱落的坏死细胞未形成管型或碎片为1分，形成管型或碎片为2分。由高年资肾病专科病理医师对肾小管损伤情况进行评价，评分越高，提示外髓部肾小管损伤越严重。

1.5 统计学分析使用SPSS 17.0统计软件，采用独立样本t检验比较2组R2*值，方差不齐时采用非参数检验；采用Wilcoxon秩和检验比较2组病理损伤评分差异。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2组不同时段大鼠肾脏外髓部R2*值比较2组不同时段大鼠肾脏外髓部R2*值见表1，BOLD-fMRI图见图1a～1c，图2a～2c，病理图见图1d，2d。

表1 不同时段大鼠肾脏外髓部R2*值（s-1，±s）

表1 不同时段大鼠肾脏外髓部R2*值（s-1，±s）

组别对比剂注射前对比剂注射后20min 24 h 48 h 72 h 7 d灯盏花素组（n=30）30.80±4.44 32.54±5.78 31.39±4.33 29.55±2.43 28.38±2.81 29.90±10.22对照组（n=30）28.65±8.25 35.09±7.87 32.63±13.46 31.77±2.74 32.78±3.08 28.67±9.12 Z值－0.151－0.680－0.076－1.170 0.000－0.265 P值＞0.05＞0.05＞0.05＜0.05＜0.05＞0.05

灯盏花素组注射对比剂20min至24 h R2*值持续升高，48 h回落直至7 d组；对照组注射对比剂20min后R2*值持续升高至72 h，7 d后回落，等于注射对比剂前。注射对比剂后48 h和72 h 2组比较，差异均有统计学意义（均P＜0.05），余时间点比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）。

2.2 2组大鼠肾脏外髓部肾小管病理损伤评分比较（表2）注射对比剂前，2组大鼠肾脏外髓部肾小管均未见明显损伤。灯盏花素组注射对比剂后20min肾脏外髓部肾小管严重损伤，24～48h损伤减轻，渐低于对照组损伤程度，72h损伤又加重，但仍低于对照组，7d后损伤减轻。对照组注射对比剂后20min肾脏外髓部肾小管即出现损伤，24～48h损伤减轻，72h损伤加重，但低于20min时，7d后损伤加重，接近20min组。注射对比剂后，24h2组损伤差异无统计学意义（P＞0.05），余时间2组差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

表2 2组大鼠肾脏外髓部肾小管损伤的病理评分比较（分，±s）

表2 2组大鼠肾脏外髓部肾小管损伤的病理评分比较（分，±s）

组别对比剂注射前对比剂注射后20min24h48h72h7d Z值＜0.001－3.10－1.77－2.70－2.26－3.24 P值＞0.05＜0.05＞0.05＜0.05＜0.05＜0.001灯盏花素组（n=30）1.90±0.786.30±0.833.60±1.361.50±0.512.50±0.511.90±0.91对照组（n=30）1.80±1.054.30±1.263.60±1.362.40±0.673.90±1.614.30±1.47

图1对照组72h大鼠肾脏图像图1a大鼠肾脏T2*解剖图图1b大鼠肾脏T2*功能图，T2*值为35.188s图1c大鼠肾脏T2*融合图图1d大鼠肾脏病理图，部分肾小管上皮细胞变性坏死，并可见管型（HE×100）图2灯盏花素组72h大鼠肾脏图像图2a大鼠肾脏T2*解剖图图2b大鼠肾脏T2*功能图，T2*值为30.938s图2c大鼠肾脏T2*融合图图2d大鼠肾脏病理图，肾小管上皮细胞肿胀，部分坏死脱落（HE×100）

3 讨论

碘对比剂所致的CI-AKI目前已经成为医源性肾功能衰竭的重要原因之一。本研究利用3.0T BOLD-fMRI技术分别观察给予生理盐水和灯盏花素注射液后大鼠肾脏外髓部R2*值变化，对照病理损害程度，以评价灯盏花素注射液在早期CI-AKI方面的抵制作用。目前认为，CI-AKI是由多种机制协同作用，如肾血流下降、渗透效应及对肾小管的直接毒性等，核心机制是对比剂引起的肾髓质损害。

3.1 CI-AKI病理生理学机制CI-AKI病理生理学机制主要是注入对比剂后，影响肾内血管活性物质分泌，诱导缩血管物质分泌增加，舒血管物质分泌减少，造成肾内血管活性物质比例失调，血流重新分布，导致肾髓质缺血缺氧，同时，对比剂自身理化效应也起一定作用。肾髓质在正常情况下为低氧输送、高氧耗的易损区。研究［8］表明，碘对比剂注入后，可引起肾内血流的重新分配，导致肾脏缺血。实验［9］发现，CI-AKI时近曲小管受损可导致髓襻升支粗段钠转运增加，同时导致的渗透性利尿和利钠，使远端肾小管重吸收增加，加重肾组织负荷，耗氧量增加，使肾髓质的氧含量明显降低，加剧组织缺氧。文献［10］报道利用微电极探针发现注入碘对比剂后可显著影响肾脏实质氧化作用，注入离子型高渗透压碘对比剂后，肾皮质氧分压从40mmHg（1mmHg=0.133kPa）下降至25mmHg，而髓质氧分压从26mmHg下降至9mmHg，以髓质缺氧更显著。注射碘对比剂后，大鼠肾脏外髓部肾小管持续性损伤，上皮细胞凋亡、坏死，管型形成是CI-AKI特征性病理改变［11］。

3.2 BOLD-fMRI对肾脏血氧代谢的评估BOLD-fMRI使用脱氧血红蛋白作为内源性对比剂，可覆盖整个肾脏，并对肾脏不同区域行R2*值测量，其定量指标R2*值（R2*=1/T2*）可更加细化研究肾脏皮质、内髓及外髓局部氧含量的变化，能有效监控、无创性评价肾脏髓质氧含量变化。R2*值降低提示局部氧含量增加，有助于评价生理和（或）病理情况下肾内氧含量的变化。2001年Prasad等［12］利用BOLD-fMRI技术对注入碘酞酸盐对比剂15min后观察大鼠肾脏皮髓质氧含量的变化。2012年Haneder等［13］利用BOLD-fMRI及DWI行猪肾脏的实验研究，对不同渗透压及黏滞度碘对比剂优维显和碘克沙醇研究发现，注入碘克沙醇及优维显后R2*值先降低，提示注入碘对比剂后首先引起肾脏血流增加，氧耗减少，随后R2*值增加，提示局部血流灌注减少，氧含量减低。刘玉品等［14］利用3.0 T BOLD-fMRI技术测得注入对比剂后大鼠肾脏外髓部R2*值最高，提示脱氧血红蛋白含量最高，氧合血红蛋白含量最低，氧含量较低。

本研究中，对照组大鼠注射对比剂后20min至72 h，肾脏外髓部R2*值呈持续升高状态，病理上大鼠肾脏外髓部间质毛细血管扩张充血，局部肾小管上皮细胞变性坏死，提示对比剂导致外髓部肾小管持续缺血缺氧，大鼠肾脏持续受损，与文献［15］报道一致。

3.3 灯盏花素对CI-AKI大鼠肾脏的影响本研究显示灯盏花素组于注射对比剂后20min～24 h，R2*值升高，提示对比剂致肾脏外髓部氧含量减低，48 h后R2*值开始回落，以72 h降低最明显，直至7 d，提示灯盏花素可改善肾脏外髓部局部氧含量，以72 h组氧含量增加最明显，对大鼠CI-AKI有一定的抵制作用，推测该作用可能与灯盏花素减轻对比剂对Na+/K+-ATP酶活性抑制作用有关［16］。

本研究表明，3.0 T BOLD-fMRI技术测得的R2*值稳定、可靠，能客观、真实反映肾脏局部氧含量情况，可评估CI-AKI引起的肾血氧含量水平变化，在监测注入碘对比剂后肾脏髓质氧分压氧代谢方面具有较高的价值，能于肾脏形态发生改变前了解肾脏的生理功能变化，早期诊断疾病，具有良好的发展应用前景。本研究不足之处：BOLD-fMRI所测R2*值临床应用仅为初步阶段，受多种因素，如耗氧量、血液供应、血细胞比容、氧分压和成像技术等的影响，数值略有偏差，使得本研究的MRI R2*值所反映的变化趋势与病理改变并非完全一致。

［1］Stacul F，van der Molen AJ，Reimer P，et al.Contrast induced nephropathy：updated ESUR Contrast Media Safety Committee guidelines［J］.Eur Radiol，2011，21：2527-2541.

［2］Deek H，Newton P，Sheerin N，et al.Contrast media induced nephropathy：a literature review of the available evidence and recommendations for practice［J］.Aust Crit Care，2014，27：166-171.

［3］Mitchell AM，Jones AE，Tumlin JA，et al.Incidence of contrastinduced nephropathy after contrast-enhanced computed tomography in the outpatient setting［J］.Clin J Am Soc Nephrol，2010，5：4-9.

［4］Kooiman J，Pasha SM，Zondag W，et al.Meta-analysis：serum creatinine changes following contrast enhanced CT imaging［J］.Eur J Radiol，2012，81：2554-2261.

［5］肖华，杨秋萍．灯盏花素对糖尿病大鼠肾组织NFKB和肾功能影响的实验研究［J］．陕西中医，2008，29（5）：624-626．

［6］石少慧，王怀颖，张晶晶，等.灯盏花素对肾缺血再灌注过氧化物酶体损伤的保护作用［J］.军医进修学院学报，2006，27（6）：438-439.

［7］Paller MS，Hoidal JR，Ferris TF.Oxygen free radicals in ischemic acute renal failure in the rat［J］.J Clin Invest，1984，74：1156-1164.

［8］Andreucci M，Solomon R，Tasanarong A.Side effects of radiographic contrast media：pathogenesis，risk factors，and prevention［J］.Biomed Res Int，2014.2014：7410-7418.

［9］Bruce RJ，Djamali A，Shink K，et al.Background fluctuation of kidney function versus contrast-induced nephrotoxicity［J］.AJR Am J Roentgenol，2009，192：711-718.

［10］Heyman SN，Brezis M，Reubinoff CA，et al.Acute renal failure with selective medullary injury in the rat［J］.J Clin Invest，1988，82：401-412.

［11］Heyman SN，Rosen S，Brezis M.Radiocontrast nephropathy：a paradigm for the synergism between toxic and hypoxic insults in the kidney［J］.Exp Nephrol，1994，2：153-157.

［12］Prasad PV，Priatna A，Spokes K，et al.Changes in Intrarenal oxygenation as evaluated by BOLD MRI in a rat kidney model for radiocontrast nephropathy［J］.J Magn Reson Imaging，2001，13：744-747.

［13］Haneder S，Michaely HJ，Schoenberg S，et al.Assessment of renal function after conformal radiotherapy and intensity-modulated radiotherapy by functional 1H-MRI and 23Na-MRI［J］.Strahlenther Onkol，2012，188：1146-1154.

［14］刘玉品，梁长虹，张水兴，等.3.0 T血样水平依赖功能MRI技术对注入碘对比剂后肾脏损害评价的实验研究［J］.中华放射学杂志，2010，44（8）：872-876.

［15］冉鹏程，刘玉品，刘波，等.3.0 T BOLD-fMRI评价丹参注射液对大鼠对比剂肾病的保护作用：与病理对照研究［J］.中国医学影像技术，2014，30（12）：1788-1791.

［16］陈子杰，石理，陈曦，等.灯盏花素对对比剂急性肾损伤大鼠肾脏Na+，K+-ATP酶活性的影响［J］.广东医学，2014，35（7）：978-981.

Effect of Breviscapine for contrast-induced acute kidney injury in rats assessed by 3.0 T blood oxygen level dependent function magnetic resonance imaging

ZHOU Dongjing，LIU Yupin，CHEN Zhiyuan，WANG Yinqiang，RAN Pengcheng，YI Hua Department of Radiology，the Second Affiliated Clinical Hospital of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou，510120，China.

Objective：To evaluate the protective effect of breviscapine for contrast agent induced acute kidney injury on rats using 3.0T blood oxygen level dependent（BOLD）magnetic resonance imaging technology.M ethods：The 60 SD rats were random ly divided into control group and breviscapine group（each n=30）respectively to the injection of contrast agent before and after continuous injection of Breviscapine and normal saline 7 d（one time everyday），BOLD-fMRI was performed on rats of each before and 20min，24 h，48 h，72 h and 7 d after injection of contrast agent，measuring rats renal outer medullary R2*values，and pathological examination in kidney of rats.After HE staining evaluation outer medullary tubular damage，analyzed and compared two groups of R2*value and pathological changes.Results：Control group rats renal outer medullary RBF value injection of contrast agent after 20 min R2*values increased，continued to 72 h，7 d after dropped to near the injection of contrast agents.Breviscapine group contrast injection 20min R2*values continued to increase to 24，48 after down continued to 7 d.Injection of contrast agent after 48 h and 72 h breviscapine group and control group the difference was statistically significant（P＜0.05），the other difference was no statistical significance（P＞0.05）.Pathological results showed that control group injection of contrast agent after 20min renal outer medullary kidney tubules damaged，reduced 24 h to 48 h after injury，72 h increased，but less than 20min，7 d after the injury was aggravated，similar to the group of 20 min；breviscapine group injection of contrast agent after 20min of renal outer medullary kidney canaliculus serious injury，reduce 24 h to 48 h after injury and gradually lower than that of the control group，the degree of injury，72 h was aggravated，but lower than control group，7 d was alleviated.After contrast injection，there was no significant difference（P＞0.05）between the two groups except the 24 h group，and the difference was statistically significant（P＜0.05）.Conclusion：3.0T BOLD technology can evaluate CIAKI induced renal blood perfusion level，reflect the treatment response of breviscapine injection on renal damage in CIAKI rats to a certain extent.

Magnetic resonance imaging；Breviscapine；Contrast-induced acute kidney injury；Rats

2016-11-30）

10.3969/j.issn.1672-0512.2017.04.002

广东省中医药局科研项目（20132124）；广东省科技计划项目（2013B021800170）。

周懂晶，E-mail：56950762@qq.com。