江虹,张琴,吴征真,秦艾

(长江师范学院 化学化工学院，武陵山片区绿色发展协同创新中心，重庆，408100)

双波长共振瑞利散射法快速测定皮蛋中的Cd

江虹*,张琴,吴征真,秦艾

(长江师范学院 化学化工学院，武陵山片区绿色发展协同创新中心，重庆，408100)

建立了快速测定皮蛋中Cd 的双波长共振瑞利散射法。在pH 5.72 的Tris-盐酸缓冲介质中，Cd(Ⅱ)与固绿FCF-溴代十六烷基吡啶结合生成三元络合物，导致体系的双波长共振瑞利散射(DWO-RRS)光谱显著增强，最大和次大共振瑞利散射峰分别位于367 nm和469 nm波长处，在此二波长处，Cd(Ⅱ) 的质量浓度在0.004～0.22 mg/L 内与体系的共振瑞利散射(RRS)增强程度△IRRS呈线性关系，检出限(3σ/S)为 1.3 ng/mL，定量限为 0.012 mg/kg。文中还研究了反应条件和共存物质的影响，反应机理及RRS 增强的原因。结果表明，方法有较高的灵敏度和良好的选择性，据此，提出了简便、快速、灵敏、准确测定痕量Cd(Ⅱ)的双波长光散射新方法，用于皮蛋中Cd的测定，回收率为 97.8%～102%，相对标准偏差(RSD)(n=5)为 2.1%～2.6%。

Cd；溴代十六烷基吡啶；固绿FCF；皮蛋；双波长；共振瑞利散射

Cd是一种对人体有害的蓄积性毒物，环境中的镉，经食物链富集后对人体的呼吸系统、消化系统及肺、肾等器官造成严重损害，并可引发骨痛病、贫血，甚至诱发癌症。皮蛋具有特殊风味，可促进食欲。而传统工艺制作的皮蛋，因生产过程中会加入黄丹粉以生成美丽的松花，由此，重金属不可避免会进入皮蛋中，从而影响产品的品质。现代工艺制作的皮蛋，若使用非食品级的CuSO4，依旧存在重金属污染问题。若人们长期食用皮蛋，则重金属将会在体内富集，对人体造成危害。鉴于此，对皮蛋中的痕量Cd进行研究具有重要意义。

目前，测定Cd 的方法主要有：原子吸收法[1-8], X射线荧光光谱法[9-10]，电感耦合等离子体质谱法[11-12]，电化学法[13-14]，分光光度法[15-16]等。原子吸收法有高的灵敏度和选择性，但所用仪器价格较贵，不易普及。X射线荧光光谱法操作简单，测试速度快，但条件要求较苛刻。电感耦合等离子体质谱法检出限低，精密度高，稳定性好，但仪器较贵，运行及维护成本高。电化学法可同时检测多种重金属离子，但检测成本较高。分光光度法操作简便、快速，分析成本低，但灵敏度不高。共振瑞利散射法是近年新发展起来的一种高灵敏分析技术，已广泛用于生化、环境、药物等分析领域，而在食品领域用得较少。本文以酸性三苯甲烷染料固绿FCF 为探针，以溴代十六烷基吡啶(TPB)为增敏剂，利用Cd(Ⅱ)对固绿FCF-TPB- Cd(Ⅱ) 体系共振瑞利散射光的线性增强作用，建立了测定痕量Cd(Ⅱ)的双波长共振瑞利散射新方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

固绿FCF(分析纯，上海迈瑞尔化学技术有限公司)，Cd(NO3)2·4H2O(99.99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，溴代十六烷基吡啶(分析纯，上海倍卓生物科技有限公司)，三羟甲基氨基甲烷(分析纯，上海源叶生物科技有限公司)，HCl、HNO3(分析纯，重庆川东化工(集团)有限公司化学试剂厂)，实验用水为超纯水。皮蛋(1#～3#)，购于重庆不同农贸市场。

1.2 仪器与设备

F-2500型荧光分光光度计，日本日立公司；pHS-3C 精密酸度计，上海虹益仪器仪表有限公司。SX-4-10高温炉，苏州江东精密仪器有限公司。

1.3 溶液的配制

固绿FCF(fast green FCF，简写为 FAG)溶液：1.0×10-4mol/L。Cd(Ⅱ)标准溶液：称取适量Cd(NO3)2·4H2O 于小烧杯中，用水溶解后配成 11.24 mg/L 贮备液，取此液稀释10倍，即得操作液。溴代十六烷基吡啶(简写为TPB)：称取适量TPB，用少量无水乙醇溶解后加水配成400 mg/L。三羟甲基氨基甲烷(Tris)-盐酸缓冲溶液：0.20 mol/L Tris溶液与0.10 mol/L盐酸混合，用酸度计测定，配成pH 3.0～9.5的系列缓冲溶液。HNO3溶液：取25.0 mL 浓HNO3，加25.0 mL 水，配成体积比为1∶1 的溶液。

1.4 样品处理

取1#～3# 皮蛋各3个，去壳后将其切碎, 研匀，准确称取1# 皮蛋28.832 5 g，2# 皮蛋29.566 3 g，3# 皮蛋28.976 2 g，分别置于瓷坩埚中，在可控电炉上低温加热至样品完全炭化，再将温度调至500～550 ℃ 灼烧灰化约6 h，取出冷却后，加3.0 mL 1∶1 HNO3润湿灰分，低温加热蒸干，再在500～550 ℃ 灼烧2 h，放冷，取出坩埚，加入2.0 mL 1∶1 HNO3溶液和5 mL 水，搅拌，低温加热至灰分完全溶解，冷却后过滤，用水定容至25 mL，即得待测液。

1.5 实验方法

准确移取适量的1.12 mg/L Cd(Ⅱ) 标准溶液或样液于10 mL 比色管中，再依次加入1.0 mL pH 5.72 Tris-盐酸缓冲溶液，3.0 mL 1.0×10-4mol/L FAG 溶液及0.10 mL 400 mg/L TPB 溶液，用水定容，摇匀，15 min 后，在荧光光度计上(设λex=λem=220 nm，测定狭缝5.0 nm)进行同步扫描，记录RRS光谱，并在367 nm 和469 nm 处分别测定体系和试剂空白的RRS强度IRRS(367 nm)、IRRS(469 nm)及I0(367 nm)、I0(469 nm)，计算△IRRS=IRRS-I0，△IRRS(367+469)=IRRS(367+469)-I0(367+469)。

2 结果与讨论

2.1 RRS光谱特征

1. Cd(Ⅱ)(0.112 mg/L); 2. FAG(3.0×10-5 mol/L); 3. TPB(4.0 mg/L); 4. FAG(3.0×10-5 mol/L), pH 5.72; 5. TPB(4.0 mg/L), pH 5.72; 6～10. Cd(Ⅱ)(0.000、0.0562、0.112、0.169、0.225 mg/L)-FAG(3.0×10-5 mol/L)-TPB(4.0 mg/L), pH 5.72图1 RRS光谱Fig.1 RRS spectra

从图1可知，单独的Cd(Ⅱ)、FAG、TPB 溶液的RRS 均十分微弱(曲线1～3)，FAG 及TPB 的酸性溶液的RRS 也十分微弱(曲线4～5)。当在FAG 的酸性溶液中加入阳离子表面活性剂TPB 后，其RRS 显著增强(曲线6)，说明TPB 可以增敏FAG，最大和次大共振瑞利散射峰分别位于 367 nm 和469 nm。在此二波长处，随着Cd(Ⅱ) 质量浓度的增加，体系的RRS 强度随之增大(曲线7～10)，Cd(Ⅱ) 在一定浓度范围内，其质量浓度与体系的RRS 增强强度(△IRRS)呈线性关系。根据散射强度的加和性，当用双波长叠加法测定时，体系的RRS 增强强度△IRRS与一定浓度范围的Cd(Ⅱ) 的质量浓度仍呈线性关系，而灵敏度却比用单波长法测定约高1倍，故可采用双波长-共振瑞利散射(DWO-RRS)法定量测定Cd(Ⅱ)的含量。

可能的反应机理：TPB 是一种阳离子表面活性剂，在溶液中可离解出Br-，变成带1个单位正电荷的阳离子活性基团，而FAG 是一种三苯甲烷类的酸性染料，在溶液中可离解出2个Na+，使自身带2个单位的负电荷。带正电荷的TPB 活性基团可与带负电荷的酸性染料FAG 以静电引力结合生成带负电荷的缔合颗粒，进而与Cd(Ⅱ) 结合生成三元络合物，使体系摩尔质量和体积均显著增大，故RRS光谱显著增强。

2.2 反应条件的选择

2.2.1 pH 值

室温下，考察了367 nm 处pH 5.0 的NaAc-HAc、Tris-盐酸及Britton-Robison(简写为BR)等缓冲溶液对三元体系△IRRS的影响。结果表明，使用Tris-盐酸时，体系的△IRRS相对较大，故选择Tris-盐酸作反应介质。继而考察了不同pH 值的Tris-盐酸缓冲溶液对三元体系△IRRS的影响(图2)。

图2 pH值对△IRRS的影响Fig.2 Effect of buffer pH on △IRRS

结果表明，溶液的pH 在 5.0～6.8 内，体系△IRRS较大，灵敏度较高。当用DWO-RRS法测定时，由于散射强度的叠加使其灵敏度更高。故实验用pH 5.72 的Tris-盐酸缓冲溶液。继而固定Cd(Ⅱ) 及固绿FCF 的浓度及用量不变，改变pH 5.72 的Tris-盐酸缓冲溶液的用量，按1.5 节的实验方法扫描 RRS 光谱，从光谱曲线得知，当缓冲溶液用量为1.0 mL 时，体系的△IRRS最大，灵敏度最高，故实验选用pH 5.72的缓冲溶液1.0 mL。

2.2.2 FAG 溶液的浓度

室温下，考察了367 nm 处不同浓度的FAG 溶液对三元体系△IRRS的影响(图3)。结果表明，FAG 溶液浓度在(2.7～3.8)×10-5mol/L 内，体系的△IRRS较大，灵敏度较高。此范围外，当FAG 的浓度小于2.7×10-5mol/L时，Cd(Ⅱ) 与FAG-TPB 未充分结合，致使△IRRS降低；当FAG 的浓度大于3.8×10-5mol/L 时，由于FAG 分子自身的聚集作用致使体系的△IRRS降低。当用DWO-RRS 法测定时，由于散射强度的叠加使其灵敏度更高。故实验选用1.0×10-4mol/L FAG 溶液3.0 mL。

图3 FAG 溶液浓度对△IRRS的影响Fig.3 Effect of fast green FCF concentration on ΔIRRS

2.2.3 表面活性剂

室温下，考察了367 nm 处阳离子表面活性剂溴化十六烷基三甲基铵和溴代十六烷基吡啶，阴离子表面活性剂十二烷基磺酸钠和十二烷基硫酸钠，非离子表面活性剂Triton X-100、Tween-20等对三元体系△IRRS的影响。结果表明,只有阳离子表面活性剂对该体系有增敏作用，其中又以TPB 为最佳。继而在固定其他条件不变的情况下，试验了不同浓度的 TPB 溶液对体系 △IRRS的影响，结果表明，适宜的TPB 溶液浓度为 4.0 mg/L，此时体系的△IRRS最大，灵敏度最高。实验表明，TPB 与FAG在酸性溶液中能以静电引力结合形成离子缔合物，当用DWO-RRS法测定时，由于散射强度的叠加使其灵敏度更高。故实验用400 mg/L TPB 溶液0.10 mL 作增敏剂。

2.2.4 试剂加入顺序

室温下，考察了367 nm 处，各试剂在不同加入顺序时对三元体系△IRRS的影响。结果表明，按1.5节的加入顺序为最佳，此时体系△IRRS最大，灵敏度最高。而用双波长法测定时，因散射强度的叠加使其灵敏度更高。故实验按此顺序进行。

2.2.5 反应时间及稳定性

室温下，考察了不同放置时间对三元反应△IRRS的影响(图4)。结果表明，反应在15 min 内可进行完全，15 min后，体系的 △IRRS基本处于一个平台上，稳定时间约2 h。实验选在15 min 后测定。

图4 时间对ΔIRRS的影响Fig.4 Effect of time on ΔIRRS

2.3 标准曲线

在最佳条件下配制Cd(Ⅱ) 的标准系列溶液，即按1.5节的方法，固定其它条件不变，加入1.124 mg/L Cd(Ⅱ) 标准溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，按实验方法配制溶液并同步扫描RRS 光谱，用DWO-RRS法测定不同浓度的Cd(Ⅱ) 与FAG-TPB 形成的三元络合物的△IRRS(367+469)，并作△IRRS(367+469)-ρ标准曲线(图5)。该方法的一元线性回归方程为△IRRS(367+469)=-7.831 6 + 4 830 ρ，相关系数为r=0.999 8，检出限为 1.3 ng/mL，定量限为0.012 mg/kg，在确定了检出限、定量限后，根据标准曲线可以确定出线性范围为0.004～0.22 mg/L。

图5 Cd(Ⅱ)的DWO-RRS法标准曲线Fig.5 DWO-RRS standard curve of cadmium (Ⅱ)

2.4 共存物质的影响

室温下，考察了某些常见物质对测定0.112 mg/L Cd(Ⅱ) 的影响。结果表明，当相对误差不大于±5% 时，以下物质不干扰测定：100倍的K+、Na+、Sr2+、Fe2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Cu2+、Ba2+、NH4+、S2O32-、SO42-、SO32-、NO3-、C2O42-、I-、Cl-；20倍的Fe3+、Al3+、Pb2+、Hg2+。可见，方法有很好的选择性。

2.5 样品分析

取1.4 节各待测液3.0 mL 按实验方法分析，各平行测定5份。同时做加标回收试验(n=5)：用固定质量称量法分别准确称取3份 1# 皮蛋28.832 5 g，3份 2# 皮蛋29.566 3 g，3份 3# 皮蛋28.976 2 g，称量的允许误差均为±0.000 1 g，根据表1中的加标量分别加入Cd(Ⅱ) 标准溶液，然后按1.4 节的方法制成各待测液，最后按1.5 节的方法扫描各溶液的RRS 光谱。根据DWO-RRS 法标准曲线或回归方程，求出各待测液中Cd(Ⅱ)的含量，从而求得原始样品中Cd 的含量，并与国标法(石墨炉原子吸收法，AAS)比较。同时求出各回收率及相对标准偏差。结果见表1。

表1 样品分析结果及回收试验(n=5)

3 结论

本法操作简便，试剂价廉易得，样品处理安全，不需分离富集，有较高的灵敏度和良好的选择性，准确度和精密度能满足痕量分析要求，测定结果与国标法接近，皮蛋含量符合国家限量要求。方法适于批量皮蛋中Cd 的快速测定。

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Fast determination of cadmium in preserved eggs by dual-wavelength resonance Rayleigh scattering method

JIANG Hong*,ZHANG Qin,WU Zheng-zhen,QIN Ai

(College of Chemistry and Chemical Engineering, Collaborative Innovation Center for Green Development in Wuling Mountain Areas,Yangtze Normal University, Chongqing 408100,China)

A new and fast dual-wavelength overlapping resonance Rayleigh scattering(DWO-RRS) method was developed to detect cadmium in preserved eggs. In a Tris-hydrochloric acid buffer medium at pH 5.72, cadmium (Ⅱ) can be bound with fast green FCF-hexadecylpyridinium bromide to form a ternary complex. As a result, the new spectra of DWO-RRS appeared and its intensities was enhanced greatly. The largest and the second largest resonance Rayleigh scattering peak were located at 367 nm and 469 nm respectively. Under these two wavelengths, resonance Rayleigh scattering (RRS) intensity (△IRRS) was directly proportional to the cadmium (Ⅱ) mass concentration in a range of 0.004-0.22 mg/L. The methods had high sensitivity with the detection limit (3σ/S) of 1.3 ng /mL and quantitation limit of 0.012 mg/kg. The optimal conditions and the effects of coexistent substances of RRS method were investigated．In addition，the reasons for RRS enhancement and reaction mechanism of ternary complex were discussed．Results indicated that this assay had a high sensitivity and good selectivity. This simple, rapid, highly sensitive, accurate and new dual-wavelength scattering method had been proposed to determine trace cadmium(Ⅱ)．The method was applied to determine the content of cadmium in a series of preserved eggs, the values of recovery and relative standard deviation (RSD) (n=5) were found in the ranges of 97.8%-102% and 2.1%-2.6% respectively.

cadmium; hexadecylpyridinium bromide; fast green FCF; preserved eggs; dual-wavelength; resonance Rayleigh scattering

学士,教授(本文通讯作者,E-mail: jianghongch@163.com)。

重庆市教委科技基金资助项目(KJ1401226);长江师范学院科技基金资助项目(2015CXX079)

2016-11-30，改回日期：2016-12-27

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706045