张南海，涂宗财,2，何娜，王辉*，黄涛，李翠

1(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌，330047)2(江西师范大学 生命科学学院，江西 南昌，330022)

尿素包合法富集鲢鱼鱼油中多不饱和脂肪酸工艺优化

张南海1，涂宗财1,2，何娜1，王辉1*，黄涛1，李翠1

1(南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌，330047)2(江西师范大学 生命科学学院，江西 南昌，330022)

以鲢鱼鱼油(乙酯型)为原料，采用尿素包合法富集鲢鱼鱼油中多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)，通过单因素和正交试验确定富集PUFAs的最佳工艺条件为∶醇脲体积质量比6∶1(mL∶g)，酯脲质量比0.3∶1，包合温度10 ℃，包合时间3 h。在最佳条件下进行验证试验，二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(decosahexaenoic acid，DHA)总含量由最初的23.09%提高到73.67%，PUFAs回收率为22.93%。

鲢鱼鱼油；尿素包合法；多不饱和脂肪酸；二十碳五烯酸；二十二碳六烯酸

二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(decosahexaenoic acid，DHA)属最重要的ω-3型多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids，PUFAs)[1]，而鱼油中富含ω-3型多不饱和脂肪酸[2]。EPA和DHA具有抗血栓、降血脂、降低总胆固醇(total cholesterol，TCHO)和低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)、促磷脂膜形成等多种重要的生理功能，对预防心血管疾病、高血压、糖尿病、炎症、癌症和促进胎儿发育等具有较好的功效[2-4]。由于人体自身的生理条件不能产生足够的EPA和DHA，故需要从外界摄取足够的鱼制品来满足人体健康的需求[5]。然而，天然鱼油中EPA和DHA的含量也不足以满足人体的需求[6]。因此，对鱼油中PUFAs乙酯化，并通过不同的方法进行富集成为国内外研究热点[7-9]。目前，国内外在鱼油富集方面主要是对深海鱼油中PUFAs进行富集[10-11]，鲜见对淡水鱼油中PUFAs进行富集的研究。

我国是淡水水产养殖大国[12]，鲢鱼是大宗淡水鱼中不饱和脂肪酸含量最高的鱼类，罗永康对7种淡水鱼肌肉和内脏中脂肪酸组成进行测定，得出鲢鱼中PUFAs含量高达54%以上，高于其他淡水鱼[13]。

目前，鱼油中PUFAs的富集工艺方法主要有：低温结晶法、尿素包合法、分子蒸馏法、超临界CO2法、银离子络合法、色谱法和酶法等[14-17]。其中，尿素包合法所需的设备简单，操作容易，生产成本低，尿素和乙醇均可回收再利用，并且低温下反应在一定程度上具有保护鱼油不被氧化的作用，该技术已比较成熟[18-20]。因此，在前期研究的基础上[21]，以高鱼油乙酯得率的鲢鱼鱼油(乙酯型)为原料，采用尿素包合法富集鲢鱼鱼油中PUFAs，研究醇脲体积质量比、酯脲质量比、包合温度和包合时间对EPA、DHA含量和PUFAs回收率的影响，确定富集工艺条件。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲢鱼鱼油(乙酯型)， 实验室自制[19]。

无水乙醇、尿素：分析纯，天津市永大化学试剂有限公司；正己烷：色谱纯、无水Na2SO4：分析纯，天津市大茂化学试剂厂；37种脂肪酸乙酯标准品：分析纯，美国NuCkek-Prep公司；其他化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ML104/02电子天平，梅特勒-托利仪器(上海)有限公司；HH-4数显恒温磁力搅拌水浴锅，常州爱华仪器制造有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵，河南省予华仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；DW-4型低温试验箱，绍兴福祥精密仪器有限公司；Agilent 7890B型气相色谱仪，美国Agilent公司。

1.3 实验方法

1.3.1 尿素包合法富集鱼油中PUFAs

称取一定量的尿素与体积分数为95%的乙醇置于250 mL烧瓶中，65 ℃恒温水浴下回流搅拌至尿素全部溶解。向其中加入一定量的鱼油乙酯(记作m0)，继续搅拌回流30 min后，置于低温实验箱中，在适宜温度下包合一定时间后，减压抽滤分离出液相，用旋转蒸发仪除去液相中乙醇，用热的饱和NaCl溶液洗涤数次至无尿素和乙醇存在，再加入一定量无水Na2SO4去除多余水分，离心后即得到富集后的鱼油(记作m1)[22]。富集后的鱼油采用气相色谱法分析其脂肪酸组成和含量。

(1)

1.3.2 气相色谱分析

色谱柱：CP-Sil 88熔融石英毛细管柱(CP 7489 100 m×0.25 mm×0.2 μm)；检测器：氢火焰离子检测器；升温程序：起始125 ℃以13 ℃/min升至160 ℃，保持26 min，再以4 ℃/min升至195 ℃，保持10 min，再以1 ℃/min升至215 ℃，保持16 min；载气(H2)流速24 mL/min，压力2.59×105Pa；进样口温度：250 ℃，进样量1 μL；分流比：10∶1。

使用气相色谱仪对富集后的鱼油进行检测，采用峰面积归一法测定鱼油中脂肪酸的含量。

1.3.3 尿素包合法富集鱼油中PUFAs工艺优化

1.3.3.1 富集单因素试验

以醇脲体积质量比、酯脲质量比、包合时间和包合温度为单因素，以EPA、DHA含量、EPA+DHA含量和PUFAs回收率为指标，通过单因素试验选出富集鱼油中PUFAs的最佳工艺范围。参考他人研究富集鱼油EPA和DHA实验[23-25]，设定本试验各因素范围如下：醇脲体积质量比(体积分数为95%的乙醇与尿素的体积质量比)为4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1(mL∶g)；酯脲质量比(乙酯型鱼油与尿素的质量比)为0.3∶1、0.4∶1、0.5∶1、0.6∶1、0.7∶1；包合温度为-10、-5、0、5、10、15、20、25 ℃；包合时间为1.0、3.0、6.0、12.0、18.0、24.0、30.0 h。

表1 L9 (34)正交实验因素水平表

1.3.3.2 富集鱼油中PUFAs工艺正交试验设计

根据上述单因素实验，选取醇脲体积质量比、酯脲质量比、包合温度、包合时间这4 个因素，每个因素取3 个水平，制定L9(34)正交实验表进行正交试验分析，以EPA+DHA含量和PUFAs回收率为指标，确定最佳工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与讨论

2.1.1 醇脲体积质量比对富集PUFAs实验的影响

图1 醇脲体积质量比对富集PUFAs的影响Fig.1 Effect of the volume-to-mass ratio of ethanol-to-urea on the enrichment of PUFAs

由图1可知，随着醇脲体积质量比的增加，尿素在乙醇中溶解越充分，增大了尿素与脂肪酸的接触机会，从而提高了脂肪酸的反应程度和选择性，即尿素包合饱和脂肪酸(saturated fatty acids，SFAs)和单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids，MUFAs)的程度增大，从而EPA+DHA含量上升，然而EPA含量先增加后降低，DHA含量先增加后降低，可能是由于与DHA相比，EPA较容易形成尿素包合物，醇脲体积质量比越大，给EPA提供的多余的空间形成尿素络合物，而导致含量降低[26]；此外，随着醇脲比的增加，鱼油也越容易溶解在体积分数为95%的乙醇中，PUFAs回收率显著升高后趋于稳定，在醇脲体积质量比为7∶1时达到最大值。因此，综合考虑，确定最佳醇脲体积质量比为7∶1。

2.1.2 酯脲质量比对富集PUFAs实验的影响

尿素在低温条件下与SFAs和MUFAs形成较稳定的晶体包合物析出，然而PUFAs因为双键数量较多，碳链弯曲，这种空间构型不易被尿素包合。由图2可知，在包合过程中，当酯脲质量比过小时，尿素不仅与SFAs和MUFAs形成包合物，也与部分PUFAs形成包合物，使得EPA和DHA含量下降，PUFAs回收率也相应下降；当酯脲质量比为0.4∶1时，尿素的用量刚好用于包合SFAs和MUFAs，此时EPA+DHA含量最大；若继续增大酯脲质量比，尿素用量不足以包合SFAs和MUFAs，导致非尿素相中SFAs和MUFAs含量增加，从而EPA和DHA含量下降，由于尿素不足以使反应完全，PUFAs回收率反而增大。因此，确定最佳酯脲质量比为0.4∶1。

图2 酯脲质量比对富集PUFAs的影响Fig.2 Effect of mass ration of fish oil-to urea on the enrichment of PUFAs

2.1.3 包合温度对富集PUFAs实验的影响

尿素包合反应是放热反应，低温条件可以促进包合物的生成(图3)。

图3 包合温度对富集PUFAs的影响Fig.3 Effect of inclusion temperature on the enrichment of PUFAs

由图3可知，当包合温度过低时，尿素形成包合物晶体速度过快，反应不充分，导致EPA+DHA含量下降，PUFAs回收率降低；随着包合温度的增加，EPA+DHA含量和PUFAs回收率逐渐增大，包合温度为15 ℃时，EPA+DHA含量达到最大；继续升高反应温度，尿素与脂肪酸形成的晶体大而粗糙，脂肪酸和尿素结合不牢固，导致SFAs和MUFAs从脲包物中脱离出来，使得EPA+DHA含量降低。因此，选择15 ℃作为最适包合温度。

2.1.4 包合时间对富集PUFAs实验的影响

由图4可知，随着包合时间的延长，EPA含量先增大后趋于稳定，DHA含量略有所下降，EPA+DHA含量先上升后略有下降，在包合时间为3h时达到最大值，为73.08%；此外，PUFAs回收率先降低后趋于稳定，可能是由于反应时间的增加，反应越充分，尿素与SFAs和MUFAs包合程度越大，非尿素相中PUFAs含量也就越大；时间过长，反而会造成资源和成本的浪费。因此，确定最佳包合时间为3.0 h。

图4 包合时间对富集PUFAs的影响Fig.4 Effect of inclusion time on the enrichment of PUFAs

2.2 正交试验分析优化富集PUFAs工艺

对表2进行分析，影响PUFAs富集效果的因素主次关系为：酯脲质量比﹥包合温度﹥醇脲体积质量比﹥包合时间。由表3可知，4 个因素均对富集PUFAs的影响有极显著差异(P<0.01)。综合表2和表3的分析结果，得出富集PUFAs的最佳工艺组合为A1B1C2D1，即醇脲体积质量比为6∶1，酯脲质量比为0.3∶1，包合温度为10 ℃，包合时间为3 h。

表2 正交试验结果

表3 方差分析结果

2.3 最佳工艺验证

根据上述结果分析，得到最佳工艺A1B1C2D1组合。按照优化的鱼油富集工艺条件，经行3次验证实验，结果如图5和表4所示。鱼油中的EPA含量为43.46%，DHA含量为29.51%，EPA+DHA含量为73.67%，鱼油回收率为22.93%，高于正交试验结果中的最优值，与富集前相比，富集后鱼油脂肪酸中SFAs和MUFAs含量明显减少，EPA和DHA含量明显提升。

表4 富集前后鱼油脂肪酸含量对比

图5 富集前后鱼油脂肪酸气相色谱图Fig.5 The fatty acid GC of fish oil ethyl ester before and after enrichment

3 结论

本实验对尿素包合法富集鱼油中PUFAs工艺条件进行优化，通过单因素和正交试验研究醇脲体积质量比、酯脲质量比、包合温度和包合时间4个因素对EPA、DHA含量和PUFAs回收率的影响，得到最佳工艺组合为A1B1C2D1，即醇脲体积质量比为6∶1(mL∶g)，酯脲质量比为0.3∶1，包合温度为10 ℃，包合时间为3 h，EPA+DHA含量为73.67%，提升了3.19倍，PUFAs回收率为22.93%，可用于制备高PUFAs含量产品，提高鱼油的附加值。该方法操作方便、生产成本低，试剂可回收再利用，有利于工厂化大规模生产。

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Enrichment of polyunsaturated fatty acids extraction in fish oil from Silver Carp by urea inclusion method

ZHANG Nan-hai1,TU Zong-cai1,2,HE Na1,WANG Hui1*,HUANG Tao1,LI Cui1

1(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330047, China)2(College of Life Science, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China)

Using fish oil from Silver Carp (ethyl ester) as raw materials, polyunsaturated fatty acids (PUFAs) extraction was enriched by urea inclusion method. The optimal process conditions were determined through single factor and orthogonal experiments. The optimum conditions were as follows: the volume-to-mass ratio of ethanol-to-urea was 6∶1(mL∶g), the mass ratio of fish oil-to urea was 0.3∶1, the inclusion temperature was 10 ℃ and the inclusion time was 3 h. Under the optimal condition, the total content of eicosapentaenoic acid (EPA) and decosahexaenoic acid (DHA) reached 73.67% from 23.09% and the PUFAs recovery was 22.93%.

fish oil from Silver Carp; urea inclusion method; polyunsaturated fatty acids; eicosapentaenoic acid; decosahexaenoic acid

硕士(王辉博士为通讯作者,E-mail：wanghui00072@aliyun.com)。

国家高新技术研究发展计划(863计划)项目(2011AA100803)；江西省现代农业产业技术体系建设专项资金资助(JXARS-03)；江西省重大生态安全问题监控协同创新中心资助项目(JSX-EW-00)

2016-10-27，改回日期：2016-11-22

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706025