李婷婷，陈思，李欢，赵前程，马堃，励建荣*

1(大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连，116600)2(西南大学 食品学院，重庆，400715)3(渤海大学 食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州，121013)4(大连海洋大学 食品科学与工程学院)，辽宁 大连，116600)

冷藏鲢鱼优势腐败菌致腐能力的初步分析

李婷婷1, 2，陈思3，李欢3，赵前程4，马堃1，励建荣3*

1(大连民族大学 生命科学学院，辽宁 大连，116600)2(西南大学 食品学院，重庆，400715)3(渤海大学 食品科学与工程学院，生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心，辽宁 锦州，121013)4(大连海洋大学 食品科学与工程学院)，辽宁 大连，116600)

为探究鲢鱼腐败菌(荧光假单胞菌、腐败希瓦氏菌和温和气单胞菌)对冷藏鲢鱼的致腐能力，以接种鲢鱼腐败菌(荧光假单胞菌、腐败希瓦氏菌和温和气单胞菌)的无菌鲢鱼块为研究对象，通过定期测定其在4 ℃贮藏过程中的感官、TVB-N值、TMA值、电导率等新鲜度指标以及腐败菌的变化情况，并以腐败菌生长动力学参数和腐败代谢产物产量因子(YTVB-N/CFU和YTMA/CFU)为指标，探讨冷藏过程中鲢鱼腐败菌的腐败能力。研究表明，接种3种腐败菌的无菌鱼块腐败速度明显优于无菌对照组；腐败希瓦氏菌的腐败能力最强，荧光假单胞菌的YTMA/CFU较低。3种腐败菌都有一定的腐败能力，但在较高数量时才会出现明显的致腐作用。

鲢鱼；腐败菌；产量因子；腐败能力

鲢鱼(Hypophthalmichtysmolitrix)作为中国著名的四大家鱼之一，养殖产量常年位于淡水鱼类前三位。鲢鱼肉质鲜嫩，含有丰富的蛋白质、氨基酸、脂肪等营养物，其中粗蛋白含量约为16.5%，有人体必需的8种氨基酸及婴幼儿所必需的组氨酸[1-2]。近年来，鲢鱼加工业发展十分迅速，鲢鱼肉色白、价格低廉、凝胶性能好，是非常适合用于工业化加工的淡水鱼种。然而，由于鲢鱼水分含量高，富含各种营养物质，在冷链物流和销售过程非常容易产生品质劣变。参与鱼类腐败的只有部分优势细菌能大量增殖。占据主导地位并最终导致鱼类腐败变质，这些产生腐败代谢产物(臭味、异味、颜色)的优势微生物被称为特定腐败菌(Specific Spoilage Organism, SSO)[3]。研究表明，在有氧冷藏条件下，腐败希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens)多为海洋鱼类的SSO，假单胞菌多为淡水鱼的SSO[3-5]。

希瓦氏菌是嗜冷的革兰氏阴性菌，腐败活性强，在低温环境下能够生长繁殖，并逐渐占主导地位，能把氧化三甲胺(trimethylamine oxide，TMAO)还原为三甲胺(trimethylamine，TMA)，产生硫化氢[6]。假单胞菌属同样是典型的低温腐败菌，具有很强的蛋白质和脂肪分解能力，腐败特征表现为硫化氢味、水果或酸臭味等异味[7]。气单胞菌在自然界中广泛存在，在鱼类等水产品常有检出。目前，关于这3种菌致腐能力差异的研究鲜有报道，为此本研究将从冷藏鲢鱼中分离得到的3种菌接种到无菌鱼块中，对其致腐能力进行测定和分析，研究结果将为进一步探究水产品致腐机制、丰富水产加工理论提供基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

养殖鲜活鲢鱼，购自锦州林西水产市场，平均重量 1.5～1.8 kg。假单胞菌CFC选择性培养基、营养琼脂、营养肉汤培养基、铁琼脂、气单胞菌培养基、假单胞菌CFC选择性培养基添加剂、气单胞菌选择性培养基，青岛海博生物科技有限公司；超微量ATP(Ca2+)试剂盒，南京建成生物工程研究所；三甲胺、磷酸盐、8-苯胺基-1-萘磺酸铵(ANS)试剂等，均为分析纯，购于天津市科密欧化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

PL602-L电子天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；FOSS凯氏定氮，丹麦福斯公司；冷冻离心机，德国Beckman制造公司；LDZX-50FBS立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；LRH-150生化培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；JHG-Q60-P100实验室均质机，上海融合机械设备有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鲢鱼无菌鱼片的制备

参照HERBERT[8]的方法制备无菌鱼块。鲜活鲢鱼，冰水致死，清洗后，无菌操作切取鲢鱼背部鱼肉，去皮，再用灭菌剪刀修剪鱼块至大小形状一致(25～35 g/块)后，将鲢鱼鱼块使用无菌水清洗，用无菌滤纸擦拭鱼块上水分，再用75%的酒精擦拭鱼块，将制备好的鱼块放在酒精灯火焰周围灼烧1～2 s。上述所有无菌操作均在无菌操作台中进行。对制备好的无菌鱼块进行菌落总数测定(<102CFU/g)，符合实验要求。

1.3.2 细菌菌悬液的制备

参考李学英等[5]的方法。菌种均保藏于-80 ℃超低温冰箱中，将从腐败鲢鱼中分离鉴定的优势腐败菌腐败希瓦氏菌、荧光假单胞菌、温和气单胞菌活化后，接种到营养琼脂培养基表面划线接种，25 ℃培养，挑取典型菌落用营养肉汤培养基25 ℃过夜培养。用麦氏比浊法制备108CFU/mL菌液，无菌生理盐水稀释100倍后备用。

1.3.3 接种及贮藏

无菌操作台中，将无菌鲢鱼鱼块分为4组，其中试验的3组放入制好的3种菌悬液中，对照组放入无菌生理盐水中，浸泡10 s，拿出沥干，装入灭菌的食品袋中，封口后置于4 ℃冰箱中贮藏。

1.3.4 TVB-N测定

TVB-N值测定依照SC/T 3032—2007《水产品中挥发性盐基氮的测定》中的微量扩散法测定。

1.3.5 TMA测定

参照GB/T 5009.179—2003《火腿中三甲胺氮的测定》和许龙福等[9]的修订方法，采用苦味酸法测定。

1.3.6 电导率测定

取鲢鱼鱼肉10 g，加蒸馏水90 mL至烧杯中，用均质机均质，搅拌30 min后过滤，所得滤液用电导率仪进行测定。

1.3.7 Ca2+-ATPase测定

参照超微量ATP(Ca2+)测试盒的操作说明进行测定。

1.3.8 表面疏水性

采用ANS荧光探针法[10]测定表面疏水性，将样品用20 mmol/L含0.6 mol/L KCl的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.0)稀释至0～1 mg/mL，加入20 μL 8 mmol/L ANS后混合均匀，避光静置10 min，荧光分光光度计测定条件为：激发波长374 nm，发射波长250～500 nm，狭缝10 nm。以荧光强度对蛋白浓度作图，曲线初始斜率即为蛋白质分子的表面疏水性指数。

1.3.9 微生物动力学模型

用修正的Gompertz描述微生物的生长动态：

(1)

式中：t为时间，h；N(t)为时间t时的菌数；Nmax，N0为最大和初始菌数，CFU/g；μmax为最大生长速率，h-1；λ为生长延滞时间。

1.3.10 腐败能力的定量分析

以单位腐败菌产生的腐败代谢产物，作为腐败能力的定量指标，腐败代谢产物因子(YTVB-N/CFU和YTMA/CFU)如下所示[4]：

(2)

(3)

式中：产量因子YTVB-N/CFU/(mg TVB-N/CFU)；YTMA/CFU/(mgTMA/CFU)；N0为初始菌落数，CFU/g；NS为货架期终点时的腐败菌菌落数即最小腐败菌落数，CFU/g；(TVB-N)0、(TVB-N)S为初始点和货架期终点时的TVB-N量，mg/100g；(TMA)0、(TMA)S为初始点和货架期终点时的TMA量，mg/100g。

2 结果与分析

2.1 TVB-N值分析

图1为接种不同菌种的鲢鱼无菌鱼块在4 ℃贮藏过程中的TVB-N值变化图。

图1 接种不同菌种的无菌鱼块TVB-N值变化趋势图Fig.1 Changes of TVB-N of different bacterial strains inoculated in sterile silver carp fillets

鱼类在贮藏过程中容易受到微生物和酶的作用使蛋白质产生分解，生成氨以及胺类等碱性含氮物质，有研究表明[11]，微生物增殖与TVB-N值的增加具有很好的一致性。从图1可以看出，接种荧光假单胞菌的鱼块贮藏初期TVB-N值变化不明显，2 d后呈直线上升趋势，可能是由于荧光假单胞菌经过短暂的延滞期后快速生长，腐败产物大量积累。接种腐败希瓦氏菌的鱼块TVB-N的累积速度仅次于荧光假单胞菌，但高出温和气单胞菌和对照组。丁婷等[12]对0 ℃冷藏三文鱼优势腐败菌的致腐能力进行分析，研究发现荧光假单胞菌具有较强的致腐能力。

2.2 TMA值分析

氧化三甲胺(trimethylamine oxide，TMAO)广泛分布于海产硬骨鱼类的肌肉中，是海产硬骨鱼类具有的一种特殊鲜味物质，淡水鱼中含量较少，每100 g鱼肉中一般含有5～20 mg TMAO[13]。接种不同菌种的鲢鱼无菌鱼块在4 ℃贮藏过程中的TMA值变化如图2所示。从图2可以看出，TMA值随着贮藏时间的延长而上升，由于淡水鱼类TMAO含量较少，所以整体TMA值较低。其中接种腐败希瓦氏菌和温和气单胞菌的鱼块TMA值呈快速增长趋势，而接种荧光假单胞菌的鱼块TMA变化趋势和对照组几乎一致，明显慢于腐败希瓦氏菌和温和气单胞菌。从TMA值变化可以说明假单胞菌还原TMAO能力较弱，与对照组相似，腐败希瓦氏菌和温和气单胞菌还原TMAO能力要强于荧光假单胞菌，这与MILLER[14]、GRAM[15]等的研究成果相一致。

图2 接种不同菌种的无菌鱼块TMA值变化趋势图Fig.2 Changes of TMA of different bacterial strains inoculated in sterile silver carp fillets

2.3 电导率分析

由于微生物蛋白酶的作用，蛋白质、脂肪等分解成大量小分子物质，产生大量离子，从而使鱼肉浸出液产生大量具有导电能力的物质[16]。贮藏时间越长，鱼肉的分解产物越多，导电能力越强，新鲜度越差。接种不同菌种无菌鱼块的电导率如图3所示。从图3可以看出，接种腐败希瓦氏菌鱼块的电导率值明显高于其他3组，可以说明腐败希瓦氏菌蛋白酶具有较强的分解活性。而接种温和气单胞菌鱼块的电导率略微高于荧光假单胞菌，空白对照组电导率值最小，说明三种微生物在增殖过程中都会分解营养物质产生离子致使鲢鱼新鲜度下降。SHEN等[17]对不同贮藏温度下虹鳟鱼鱼片的电导率进行分析，研究发现随着贮藏时间的延长，电导率呈上升趋势，而贮藏温度越低电导率增加越缓慢，可能是低温抑制微生物的活动，从而降低了营养物质的分解速率。

图3 接种不同菌种的无菌鱼块电导率值变化趋势图Fig.3 Changes of electric conductivity of different bacterial strains inoculated in sterile silver carp fillets

2.4 Ca2+-ATPase活性分析

肌球蛋白是肌原纤维蛋白的主要部分，ATPase位于肌球蛋白的头部，当肌球蛋白在冷藏过程中发生变性时，ATPase活性已因受到影响而随之变化，从而失去活性[18]。因此Ca2+-ATPase活性是评定蛋白质品质的重要指标，测定ATPase活性的变化可以反映出肌球蛋白的变化情况，继而反映出肌肉的变化情况[19]。接种不同菌种无菌鱼块的Ca2+-ATPase活性如图4所示。由图4可知，整个贮藏过程中鲢鱼Ca2+-ATPase活性呈下降趋势，其中，接种温和气单胞菌和荧光假单胞菌的无菌鱼块Ca2+-ATPase活性在贮藏中后期与对照组相比出现明显下降，而接种腐败希瓦氏菌的鱼块在贮藏中期Ca2+-ATPase活性甚至略高于对照组，说明微生物活动可能不是引起鲢鱼Ca2+-ATPase活性变化的主要原因。

图4 接种不同菌种的无菌鱼块Ca2+-ATPase活性变化趋势图Fig.4 Changes of Ca2+-ATPase activity of different bacterial strains inoculated in sterile silver carp fillets

2.5 表面疏水性指数分析

低温贮藏过程中鱼肉蛋白质的变性还表现为蛋白质疏水性的变化。维持蛋白质三级结构稳定的作用力是疏水基的作用，蛋白质疏水性能够反映蛋白质分子疏水性氨基酸的相对含量，因而可用它来表征蛋白质的变性程度[20]。接种不同菌种鱼块的表面疏水性指数变化如图5所示，在整个贮藏过程中，表面疏水性指数先快速上升后趋于平缓。其中，接菌鱼块表面疏水性指数在贮藏6 d后趋于平缓，对照组在贮藏8 d后趋于平缓，可以说明微生物繁殖和活动可以明显加快蛋白质的变性速度，导致鱼肉新鲜度下降。

图5 接种不同菌种的无菌鱼块表面疏水性指数变化趋势图Fig.5 Changes of surface hydrophobicity of different bacterial strains inoculated in sterile silver carp fillets

2.6 菌落总数分析

接种3种腐败菌后，鲢鱼鱼块的菌落总数的变化如图6所示。从图6可以看出，经过75%酒精擦拭的对照组鱼块菌落总数小于102CFU/g，说明无菌鱼块符合标准。接种后的腐败希瓦氏菌、荧光假单胞菌和温和气单胞菌经过短暂的延滞期后均快速增长，在这个过程中腐败产物大量积累，致使鱼肉腐败变质。

表1为3种腐败菌用修正的Gompertz方程拟合所得的动力学参数，回归系数R2都在0.98以上，说明拟合精度较高，其中荧光假单胞菌的延滞期明显较长，这也解释了接种荧光假单胞菌的鱼块各种指标贮藏初期变化较慢。

图6 接种不同菌种的无菌鱼块菌落总数变化趋势图Fig.6 Changes of total viable counts of different bacterial strains inoculated in sterile silver carp fillets

表1 鲢鱼腐败菌4 ℃贮藏过程中生长动力学参数

2.7 腐败菌致腐能力分析

表2是接种荧光假单胞菌、腐败希瓦氏菌和温和气单胞菌的无菌鱼块在4 ℃贮藏过程中初始点及腐败点的菌落总数、TMA值、TVB-N值。通过公式(2)、公式(3)可以计算得出3种腐败菌在无菌鲢鱼鱼块中的产量因子YTVB-N/CFU和YTMA/CFU。

表2 接菌鱼块贮藏过程中初始点和腐败点的TVB-N值、TMA值和菌落数

表3为荧光假单胞菌、腐败希瓦氏菌和温和气单胞菌接种无菌鱼块后的产量因子。其中，腐败希瓦氏菌的两项产量因子最高，说明腐败希瓦氏菌具有很强的致腐能力，而荧光假单胞菌的TMA产量因子最低，这与许振伟[21]等的研究结果相一致。温和气单胞菌的TVB-N和TMA产量因子并不弱于荧光假单胞菌。由于3种腐败菌的产量因子都很小，必须在数量较高时才能发挥作用。

表3 三种腐败菌的产量因子

3 结论

以鲢鱼无菌鱼块为介质，接种鲢鱼的特定腐败菌荧光假单胞菌，腐败希瓦氏菌和温和气单胞菌，研究TVB-N值、TMA值、菌落总数等指标的变化情况，并用修正的Gompertz对腐败菌的生长动态进行分析。结果显示，接种腐败菌的鱼块新鲜度下降速度明显优于无菌对照组。以TVB-N和TMA为腐败产物定量指标对3种腐败菌进行致腐能力分析，结果发现腐败希瓦氏菌致腐因子明显较高，荧光假单胞菌的TMA产量因子较低。3种腐败菌都具有一定的致腐能力，但都需要微生物积累到一定数量才会产生明显的致腐效果。

[1] Shi C, Lu H, Cui J, et al. Study on the predictive models of the quality of silver carp (Hypophthalmichthysmolitrix) fillets stored under variable temperature conditions[J]. Journal of Food Processing and Preservation, 2014, 38(1): 356-363.

[2] 张慧芳, 李婷婷, 晋高伟, 等. HS-SPME-GC-MS 技术对冷藏鲢鱼片挥发性成分变化的分析[J]. 食品科学, 2014, 35(24): 130-135.

[3] Gram L, Dalgaard P. Fish spoilage bacteria-problems and solutions[J]. Current opinion in biotechnology, 2002, 13(3): 262-266.

[4] 赵二科, 朱军莉, 冯立芳, 等. 冷藏大黄鱼SSO希瓦氏菌致腐能力差异机制初探[J]. 水产学报, 2015, 39(2): 256-264.

[5] 李学英, 杨宪时, 郭全友, 等. 大黄鱼腐败菌腐败能力的初步分析[J]. 食品工业科技, 2009(6): 316-319.

[6] Parlapani F F, Meziti A, Kormas K A, et al. Indigenous and spoilage microbiota of farmed sea bream stored in ice identified by phenotypic and 16S rRNA gene analysis[J]. Food microbiology, 2013, 33(1): 85-89.

[7] 李琳, 潘子强. 水产品特定腐败菌的确定及生长模型建立研究进展[J]. 食品研究与开发, 2011, 32(6): 152-156.

[8] HERBERT R A, HENDRIE M S, GIBSON D M, et al. Bacteria active in the spoilage of certain sea foods[J]. Journal of Applied Bacteriology, 1971, 34(1): 41-50.

[9] 许龙福, 俞飞兰, 胡振友, 等. 火腿中三甲胺氮测定方法的修订及验证[J]. 预防医学论坛, 2001, 11(6): 641-643.

[10] HUANG Y R, HUA Y F, QIU A Y. Soybean protein aggregation induced by lipoxygenase catalyzed linoleic acid oxidation [J]. Food Research International, 2006, 39(2): 240-249.

[11] 晋高伟, 李婷婷, 姜杨, 等. 0 ℃冷藏温度下草鱼新鲜度评价[J]. 食品工业科技, 2014, 35(13): 312-316.

[12] 丁婷, 李婷婷, 邹朝阳, 等. 冷藏三文鱼片特定腐败菌致腐能力测定与分析[J]. 食品工业科技, 2015, 36(18): 315-319.

[13] CIVERA T, TURI R M, PARISI E, et al. Further investigations on total volatile basic nitrogen and trimethylamine in some Mediterranean teleosteans during cold storage [J]. Sciences des Aliments, 1995, 15(2): 179-186.

[14] Miller A, Scanlan R A, Lee J S, et al. Volatile compounds produced in sterile fish muscle (Sebastesmelanops) by Pseudomonas putrefaciens, Pseudomonas fluorescens, and an Achromobacter species[J]. Applied Microbiology, 1973, 26(1): 18-21.

[15] Gram L, Wedell-Neergaard C, Huss H H. The bacteriology of fresh and spoiling Lake Victorian Nile perch (Latesniloticus) [J]. International Journal of Food Microbiology, 1990, 10(3): 303-316.

[16] 张丽娜, 罗永康, 李雪, 等. 草鱼鱼肉电导率与鲜度指标的相关性研究[J]. 中国农业大学学报, 2011, 16(4): 153-157.

[17] Shen S, Jiang Y, Liu X, et al. Quality assessment of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) fillets during super chilling and chilled storage[J]. Journal of food science and technology, 2015, 52(8): 5204-5211.

[18] BENJAKUL S, VISESSANGUAN W, AEWSIRI T, et al. ATPase activities and autolysis of kuruma prawn Penaeus japonicus muscle proteins [J]. International Aquatic Research, 2011, 3: 53-61.

[20] BENJAKUL S, BAHER F.Physicochemical and enzymatic changes of cod muscle proteins subjected to different freeze-thaw cycles [J]. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2000, 80(8): 1143-1150.

[21] 许振伟, 许钟, 杨宪时, 等. 大黄鱼中复合腐败菌腐败能力的分析[J]. 食品科学, 2010, 31(23): 118-122.

Analysis of spoilage ability of specific spoilage organism in refrigerated silver carp

LI Ting-ting1,2, CHEN Si3, LI Huan3, ZHAO Qiancheng4, MA Kun1, LI Jianrong3*

1(College of Life Science, Dalian Minzu University，Dalian 116600，China)2(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715,China)3(College of Food Science and Technology, Bohai University,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage, Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products, Jinzhou 121013,China)4(College of Food Science and Engineering, Dalian Ocean University, Dalian 116023,China)

To explore the spoilage abilities of specific spoilage organismPseudomonasfluorescens,AeromonassobiraandShewanellaputrefacienson refrigerated silver carp, freshness indexes including sensory evaluation, TVB-N, TMA, electric conductivity and total viable counts of sterile silver carp tissue respectively inoculated with these three kinds of spoilage bacteria were measured periodically. The yield factor for production of metabolite and the cell concentration at off-odour period were quantitatively measured. Results showed the freshness of sterile silver carp tissue blocks inoculated with spoilage bacteria deteriorated obviously compared with the sterile control group.Shewanellaputrefacienshad the strongest spoilage ability, and YTMA/CFUofPseudomonasfluorescenswas lower than that ofShewanellaputrefaciensandAeromonassobira. Three kinds of spoilage bacteria had certain spoilage abilities. However, the spoilage effect was not significant until the bacteria reached high counts.

Silver carp; specific spoilage organisms; yield factor; spoilage ability

博士，副教授(励建荣教授为通讯作者，E-mail：lijr6491@163.com)。

国家自然科学基金(31301572，31471639)；重庆市项目博士后资助 (Xm2014041)；国家科技支撑计划课题(2015BAD16B08)

2016-07-23，改回日期：2016-08-28

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201706023