方超逸 傅 红，3 颜亚真 傅彦君 张 虹 郑 超

(福州大学生物科学与工程学院1，福州 350108) (丰益(上海)生物技术研发中心有限公司2，上海 200137) (福州大学酶工程研究所3，福州 350108)

乙基纤维素对油脂中维生素A体外消化释放速率的影响

方超逸1傅 红1，3颜亚真1傅彦君1张 虹2郑 超2

(福州大学生物科学与工程学院1，福州 350108) (丰益(上海)生物技术研发中心有限公司2，上海 200137) (福州大学酶工程研究所3，福州 350108)

以乙基纤维素EC100作为油脂质构剂添加到起酥油样品中，研究其控制性释放脂溶性维生素A的特性。体外模拟消化试验表明EC100具有显著的缓释作用，随着EC100质量分数的增加(0%～6%)，起酥油样品消化2 h时VA的累积释放率由20.52% 降低至3.62%。Ritger-Peppas 方程式拟合得到维生素A溶出参数n为0.45～0.89，显示VA的释放速率受化合物自身扩散和骨架溶蚀双重控制。扩散系数的测定结果验证了VA的浓度梯度是扩散的驱动力，且随着油脂中EC100质量分数的增加(0%～6%)，VA在有机凝胶剂中的扩散系数呈降低趋势；侵蚀试验结果表明,当贮藏时间越长、贮藏温度越低及EC100添加量越大时，有机凝胶剂样品的侵蚀常数降低，并且添加乳化剂分子蒸馏单甘酯(DMG)的有机凝胶样品受侵蚀的程度较小。

乙基纤维素 维生素A 控制释放 体外消化

有机凝胶剂具有固定植物油等疏水性液体成分和类似于固体流变学特性的基本属性，在构建脂类超分子结构方面发挥越来越重要的作用，是食品、化妆品和药品领域迅速发展起来的新型分子功能材料[1]。Dey等[2]和Laredo等[3]发现了高聚物乙基纤维素能够有效地用于油脂凝胶化，当添加量为2% 时即可形成凝胶网络结构，并具有长期的物理稳定性[4-5]；罗淑玲等[6]研究发现在不同黏度等级EC油凝胶中，EC100的油凝胶网络强度、硬度等物理性质最佳。然而，有机凝胶剂在食用油脂中的营养生理学特性很少被研究，它们可能对脂溶性营养素的释放起到控制作用。例如Hughes等[7]的研究表明，β-胡萝卜素强化脂通过添加12-HSA形成有机凝胶从而减缓β-胡萝卜素在体外胃模型中的释放速率；Duffy等[8]的研究显示β-谷甾醇和Γ-谷维素按一定的比例添加到食用油中，所形成的有机凝胶化产品也影响了脂类的消化。

VA是人体必不可少的脂溶性营养元素，具有维护人体正常生长、发育等重要生理功能，但食品基质等因素会影响其生物利用率。因此，如何使VA在体内缓慢释放并被最大程度地利用是一个具有科学意义和应用前景的课题。本研究以EC100作为有机凝胶剂，采用体外模拟消化的方法，对含有VA的有机凝胶化起酥油样品进行了体外释放性能的测定。此外通过测定扩散系数和侵蚀常数对乙基纤维素的缓释机理进行了初步的探讨，以确定其在油脂中形成有机凝胶体系后对VA在体外模型中的释放特性的作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与原料

大豆油：市售；棕榈硬脂：上海丰益有限公司；乙基纤维素EC100(特性黏度值90～110 mPa·s)：阿拉丁试剂有限公司；分子蒸馏单甘酯(DMG)、司盘60、三聚甘油单硬脂酸酯(PGE)、单双硬脂酸甘油酯(GMS)：河南奥尼斯特食品有限公司；猪胰脂酶(纯度≥30 u/mg)、VA油(纯度≥30%)：合肥博美生物科技有限公司；牛磺胆酸纳(纯度≥97%)：源叶生物科技有限公司；氯化钙、磷酸二氢钾、氢氧化钠、石油醚、三氯甲烷、乙酸酐、正己烷均为分析纯：国药集团化学试剂有限公司；氯化锑(分析纯)：上海麦克林生物有限公司。

1.2 主要仪器与设备

SHP-1500低温生化培养箱：上海精宏实验设备有限公司；可见-紫外分光光度计：北京普析通用仪器股份有限公司；CF16RX-Ⅱ日立高速冷冻离心机：天美(中国)科学仪器有限公司；LGJ-10真空冷冻干燥机：北京松源华兴科技发展有限公司；BK-POLR偏光显微镜：重庆奥特光学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 起酥油样品的制备

以大豆油和棕榈硬脂为基料油，向其中添加不同质量分数的EC100，按照国标规定的最大添加量加入VA(8 000 μg/kg)，再经过乳化、急冷、捏合过程制成含乙基纤维素有机凝胶剂的起酥油样品。

1.3.2 起酥油的体外模拟消化

按照国标规定配制模拟肠道消化液[9]。取15 g起酥油样品，依次加入100 mL消化液、25 mL 5 g/L牛磺胆酸纳和10 mL浓度为1.98 mol/L的氯化钙溶液。在30 s内完成上述操作，并将烧杯放入(37±0.5)℃恒温水浴进行消化[10]。待体外模拟消化结束后，将消化后的乳状液倒入分液漏斗使其静置分层，分离出水层，往水层中加20 mL石油醚萃取VA，在转速4 000 r/min条件下离心10 min，取上清液10 mL于平底烧瓶，将石油醚旋蒸干净，剩余物用三氯甲烷定容至10 mL容量瓶中[11]。

1.3.3 维生素浓度变化的测定

三氯化锑显色法测定水层中VA浓度[12]：用三氯甲烷对VA进行定容，在510 nm处用三氯化锑显色法测其吸光值，绘制标准曲线，计算出其浓度。

1.3.4 释放动力学参数的测定

样品中VA释放速率用Ritger-Peppas 方程式(1)进行拟合。

Mt/M∞=ktn

(1)

式中：Mt/M∞为t时刻VA累积释放分数；t为释放时间/h；K为释放动力学常数，其大小表示释放速率的快慢；n为溶出参数，是释放机制的特征参数。当n<0.45 时为扩散控制；当0.450.89 时，为溶蚀控制[13]。

1.3.5 有机凝胶中维生素扩散系数的评价研究

维生素在有机凝胶中的扩散系数是根据Upadrashta等[14]的方法进行测定。制备EC100质量分数分别为0%～6%的起酥油样品(不含维生素)，将样品注入塑料注射器中。在该注射器一端切面上均匀涂上VA，然后放置在37 ℃生化培养箱中进行扩散。7 d后，取出注射器，油基质被切成1.5 mm的切片(如图1)，加入正己烷萃取，测量上清液在325 nm处的吸光值。

图1 每个凝胶切片中VA浓度的测定

对照标准曲线，计算每个切片中的维生素含量，凝胶中物质的扩散遵循菲克定律，按公式(2)进行计算[14]。

(2)

式中：Ci为I切片中的VA浓度；C0为有机凝胶边界的VA浓度；erf为误差函数；x为从有机凝胶边界到I切片中心的距离；Di为扩散系数；t为时间。误差函数如公式(3)所示，通过查误差函数表，得到Z值，再通过Z值的大小计算出扩散系数Di。

(3)

1.3.6 有机凝胶侵蚀速率的测定

添加EC100的凝胶型起酥油样品被称重后，将其置于37 ℃条件下的模拟肠道消化液中进行消化反应。消化2 h后，取出未被消化的有机凝胶样品，并置于真空下冷冻干燥12 h。起酥油样品消化之前和消化之后的重量分别被测定，按照公式(4)来计算侵蚀速率常数[15]。

(4)

式中：Wd和Wi分别为有机凝胶型起酥油样品消化之后和之前的质量;k为侵蚀常数;t是消化的时间。

1.3.7 显微镜观察分析晶型

取适量样品于载玻片上，盖上盖玻片，轻压成透明薄片，用偏光显微镜(PLM)观察样品的结晶形态。选择具有代表性的区域拍照3次，取其中较清晰的图片进行比较。

2 结果与讨论

2.1 释放特性的研究

2.1.1 EC100的质量分数对维生素A释放速率的影响

由图2可知，添加EC100的起酥油样品，其VA释放率都会随着消化时间的增加而呈上升的趋势。在空白对照样品中，VA被迅速释放，其他质量分数EC100的有机凝胶中VA的释放速率显著下降。当EC100的添加量依次为1%～6%时，消化2 h VA的累积释放量分别为18.92%、16.39%、11.41%、5.69%、5.25%、3.62%；通过纵向对比可知，当消化时间相同时，VA的释放率会随着EC100添加量的增加而呈现下降的趋势。以上结果可能是由于乙基纤维素这类长碳链聚合物作为油脂的质构剂，在不饱和油脂分子簇中表现出较强的氢键密度，从而产生更强的凝胶性能，其表观黏度和硬度均会随着乙基纤维素质量分数的增加而增加，这与罗淑玲等[6]的研究结果相一致。VA分子通过EC100形成的大分子缠结状网络结构，缓慢向外扩散而释放，因此乙基纤维素具有控制释放脂溶性维生素的潜力。

图2 不同质量分数EC100的起酥油样品中VA的释放率随时间的变化

2.1.2 EC100有机凝胶的释放动力学参数

将添加EC100的起酥油样品的释放速率用Ritger-Peppas 方程式(1)进行拟合，所得溶出参数n如表1所示。

表1 EC100形成的有机凝胶的溶出参数

由表1可知，任何EC浓度的起酥油样品其溶出参数都落在0.45～0.89的范围内，因此VA的释放是以化合物自身扩散和骨架溶蚀协同作用为主。这和以12-HSA为质构剂形成的油凝胶不同，12-HSA形成的有机凝胶中亲脂性化合物的扩散作用主要是受骨架溶蚀作用控制[16]。

2.2 VA扩散系数的测定

化合物释放的机制一般分为扩散控制释放体系和侵蚀控制释放体系。前者通过降低基质中的化合物扩散速率来控制释放速率。而后者的控制性释放是通过水或酶等其他物质的侵蚀。本试验对不同质量分数EC100构成的起酥油样品中VA的扩散系数进行测定。各个切片中VA浓度与边界的距离关系如图3所示。

图3 起酥油样品切片中VA浓度与边界距离的关系

由图3可知，样品切片中VA的浓度都会随着离边界距离的增加而减少。由此结果可知，有机凝胶剂中VA的浓度是扩散的驱动力。这与菲克定律所提出的扩散总是向低浓度的方向进行的理论一致。

有机凝胶中VA的扩散系数在表2中列出，结果表明在低、中、高3种VA浓度下，有机凝胶剂中VA的扩散系数均随着EC100添加量的增加而呈现出减小的趋势。这是因为随着EC100添加量的增加，起酥油中所形成的液晶网络结构更加稳定和致密，网络强度和硬度更大阻碍了VA的扩散作用影响了其扩散的效率，这与前面释放速率降低的结论相一致。因此，扩散控制是乙基纤维素缓释功能的作用机制之一。

表2 有机凝胶剂中维生素A 的扩散系数

注：扩散系数Di1、Di2、Di3的VA浓度分别为低质量浓度0.5 g/mL、中质量浓度1 g/mL、高质量浓度1.5 g/mL。

2.3 EC100有机凝胶侵蚀常数的测定

2.3.1 EC100质量分数及贮藏时间对有机凝胶侵蚀常数的影响

贮藏时间分别为1个月、2个月、3个月的条件下，EC100质量分数不同的起酥油样品其侵蚀常数的变化如图4所示。

图4 EC100质量分数及贮藏时间对有机凝胶剂侵蚀常数的影响

由图4可知，在贮藏时间相同的条件下，凝胶的侵蚀常数则随着EC100添加量的升高呈现减小，说明有机凝胶剂的浓度越高，所形成的网络结构硬度越高致密性越高，样品越难被侵蚀，这与相关研究结果一致。为了验证贮藏时间对有机凝胶剂形成的网络结构的影响，利用偏光显微镜对EC100添加量为3%而贮藏时间不同的样品进行观察，结果如图5所示。

图5 贮藏时间对样品晶体形态的影响

由图5可知，贮藏时间越长，所形成的晶体尺寸较大数目较多且排列更为致密。应用盒维数法分析样品的三维结晶网络，得出不规则碎片维数Db，结果如表3所示。影响不规则碎片维数Db值的因素主要有晶体大小、形态以及结晶面积等，通常Db值越大表明结晶网络结构被填充的越紧密。表3中，随着贮藏时间的延长，样品的Db值也越大。这与偏光显微镜观察结果一致。

表3 贮藏时间不同的样品其不规则碎片维数Db值

2.3.2 贮藏温度对EC100有机凝胶侵蚀速率的影响

样品的贮藏温度分别为4、25、37 ℃，温度对有机凝胶侵蚀常数的影响如图6所示。由图6可知，EC100添加量相同的起酥油样品，其侵蚀常数会随着贮藏温度的升高而变大，而在空白对照样中，3种贮藏温度下的侵蚀常数并没有很大的差别，这是因为样品中不含有机凝胶剂，不存在受温度影响的液晶网络结构。

图6 贮藏温度对有机凝胶剂侵蚀常数的影响

2.3.3 乳化剂对EC100有机凝胶侵蚀常数的影响

乳化剂作为表面活性剂对油脂的成核过程和晶型转变都有一定的影响。本试验选用4种不同的乳化剂：DMG、司盘60、PGE、GMS，研究乳化剂对有机凝胶侵蚀常数的影响。

由图7可知，添加单双硬脂酸甘油酯(GMS)的有机凝胶样品其侵蚀常数最大，最易被侵蚀；其次是添加司盘60和三聚甘油单硬脂酸酯(PGE)的有机凝胶样品；添加分子蒸馏单甘酯(DMG)乳化剂的有机凝胶样品侵蚀常数最小，最不易受到侵蚀。

图7 不同乳化剂对样品侵蚀常数的影响

如图8所示，添加不同乳化剂的乙基纤维素型起酥油样品，其晶体形态不同。添加DMG乳化剂的样品，晶体尺寸较大，结构更稳定，故侵蚀常数最小；添加GMS乳化剂的样品，晶体尺寸最小，排列分散，形成的凝胶网络结构不稳定，故最容易被侵蚀。各个样品的Db值如表4所示，添加DMG的样品Db值最大，添加GMS的样品Db值最小，这与偏光显微镜的观察结果一致。

表4 储存第7天时不同乳化剂样品的不规则碎片维数Db值

图8 乳化剂对样品晶体形态的影响

3 结论

体外模拟消化试验结果表明EC100具有显著的控制性释放脂类生物活性物质的特性。VA的释放速率用Ritger-Peppas 方程式进行拟合，得到的溶出参数n均为0.45～0.89，可知释放VA的速率受化合物本身扩散和骨架溶蚀双重控制。扩散系数的测定结果表明有机凝胶剂中VA的浓度梯度是扩散的驱动力，VA的扩散系数会随着乙基纤维素添加量的增加而减少；当贮藏时间越长、贮藏温度越低、EC100添加量越大，有机凝胶样品的侵蚀常数降低，并且添加乳化剂DMG的有机凝胶样品受侵蚀的程度较小。

志谢：本研究由丰益(上海)生物技术有限公司的金龙鱼营养与安全研究基金资助。

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Effect of Ethyl Cellulose on Release Rate of Vitamin A of OilinVitroDigestion

Fang Chaoyi1Fu Hong1，3Yan Yazhen1Fu Yanjun1Zhang Hong2Zheng Chao2

(College of Biological Science and Engineering，Fuzhou University1，Fuzhou 350108) (Wilmar(Shanghai)Biotechnology Research & Development Center Co.Ltd.2，Shanghai 200137) (Enzyme Engineering Research Institute，Fuzhou University3，Fuzhou 350108)

Ethyl cellulose(EC100)was added to shortening sample as the grease enzyme，and its characteristic as a controlled release formulation for vitamin A was investigated.Invitrodigestion model test indicated that EC100 had significant sustained action for release rate of VA.When the shortening sample had been digested for 2 hours，the VA cumulative release rate reduced from 20.52% to 3.62% while the mass fractions of EC100 ranged from 0% to 6%.With being fitted by Ritger-Peppas equation，the dissolution parameters of VA appeared within the scope of 0.45～0.89，which implied the release rate of VA was controlled both by compounds diffusion and matrix erosion.The measurement results of the diffusion coefficient showed that the VA concentration gradient was the driving force of diffusion，while the diffusion coefficient of VA in organic gel tended to decrease as the mass fractions of EC100 increased from 0% to 6%.Meanwhile，the erosion experiment indicated that the erosion constant of organic gel sample decreased with the extension of storage time，fall of storage temperature and amount increase of EC.The erosion of organic gel sample was decreased after adding DMG.

ethyl cellulose，vitamin A，controlled release，invitrodigestion

2015-11-10

方超逸，女，1991年出生，硕士，食品科学

傅红，女，1970年出生，教授，食品脂质开发与应用

TS221

A

1003-0174(2017)06-0079-06