曹 瑾，杨壮群，Abidullah Khan，舒茂国，温绣蔺，王 瑞，白转丽

西安交通大学第一附属医院整形美容颌面外科(西安 710061)

甲基莲心碱对紫外线致人皮肤成纤维细胞形态结构的影响*

曹 瑾，杨壮群，Abidullah Khan，舒茂国，温绣蔺，王 瑞，白转丽△

西安交通大学第一附属医院整形美容颌面外科(西安 710061)

目的：探讨甲基莲心碱对紫外线致人成纤维细胞形态结构的影响，为防治皮肤光老化性疾病提供实验依据。方法：建立中长波紫外线辐射人皮肤成纤维细胞光老化模型，实验分为对照组、模型组(单纯紫外线照射)和药物组(紫外线照射加甲基莲心碱干预)，观察和分析成纤维细胞经紫外线照射后细胞生长形态和超微结构变化。结果：紫外线照射成纤维细胞后，细胞失去正常形态，超微结构显示线粒体损伤，而经甲基莲心碱处理后细胞损伤明显减轻。结论：适当浓度(0.8μM)的甲基莲心碱能减轻紫外线照射后成纤维细胞的结构损伤，为防治皮肤光老化疾病提供了新的治疗思路。

由紫外线辐射(Ultraviolet radiation, UVR)所致的皮肤老化称光老化。随着臭氧层的破坏和紫外线辐射量的增加，皮肤光老化受到越来越高的重视。研究表明，ROS介导的氧化损伤是UVR导致皮肤光老化的重要机制[1-3]。而植物类抗氧化剂的抗光老化作用越来越成为研究热点。甲基莲心碱(Neferine, Nef)是一种从莲子芯中提取出的生物碱。研究表明Nef具有抗氧化等多种药理作用[4-7]，而Nef是否具有抗皮肤光老化作用目前国内外未见研究报道。本研究通过建立中长波紫外线辐射人皮肤成纤维细胞光老化模型，观察成纤维细胞经紫外线照射后细胞生长形态和超微结构变化，以及甲基莲心碱对成纤维细胞紫外线照射后细胞结构改变的影响，现报告如下。

材料与方法

1 人皮肤成纤维细胞株(HSFs) 购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

2 仪器和试剂 Nef(pure one Biotechnology laboratories公司)，无酚红DMEM培养基(ref#21063-029，Gibco life technologies公司)，0.25%胰蛋白酶(Gibco life technologies公司)，胎牛血清(SV30087.01，Hyclone thermo scientific公司)，DPBS(SH30256.01B， Hyclone thermo scientific公司)，DMSO(Hyclone thermo scientific公司)，MTT试剂盒(G020-1，南京建成生物工程研究所)

3 甲基莲心碱的配制 将10 mg的甲基莲心碱溶解于0.2 ml的DMSO之后加入125 ml无酚红高糖DMEM稀释，配制成浓度128 μmol/L的母液，过滤除菌后-20℃避光保存。正式实验时根据预实验初步确定的浓度范围，将母液倍比稀释，配制浓度分别为12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025 μmol/L甲基莲心碱溶液，分装于无菌离心管中，现配现用。

4 MTT法检测细胞增殖活性及药物最适浓度 人皮肤成纤维细胞以1×104/孔的浓度接种在96孔板中，于37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养24 h后加入含不同浓度Nef的DMEM溶液 100 μl，每个浓度组设5个复孔，孵育24 h，然后向每孔加入50 μl MTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，继续培养4 h后吸去孔内培养液，加入DMSO 150 μl/孔，振荡 5min。用酶联免疫检测仪在OD490 nm处测量各孔的吸光值，空白试剂孔调零，重复测量3次，处理数据，计算出各组细胞的增殖活性。根据细胞活性检测结果选择出三组合适的药物浓度用于后续实验。

5 实验分组 实验分为空白对照组：不使用甲基莲心碱及紫外线干预；模型组：仅接受UVA+UVB照射；药物组：UVA+UVB照射后加不同浓度Nef。根据MTT实验确定的3个最适浓度，将药物组分为3个不同浓度组。

6 紫外线照射 人皮肤成纤维细胞接种至100 mm ×20 mm大小培养皿中，生长至80%～90%融合时弃去培养皿内培养液，PBS清洗2遍后换以少量不含胎牛血清的DMEM覆盖细胞，模型组及药物组放置在紫外线灯箱内，紫外线光源由2个UVA和1个UVB灯管组成，我们选取辐射剂量UVA为20J/cm2以及UVB为40mJ/cm2，辐射距离为15 cm，对照组同时放置在灯箱外相似环境下，照射完后弃去培养液，对照组及模型组换以不含胎牛血清的DMEM培养基，药物组换以三组含不同浓度的Nef的无血清培养基，继续培养24 h后收集细胞用于后续实验。

7 光学显微镜和透射电镜细胞样品制备 光镜样品制备：细胞分组处理完后立即换以含不同浓度Nef的培养基继续培养24 h，PBS清洗后直接用于光镜下观察细胞形态；电镜样品制备：细胞分组处理完后立即换以含不同浓度Nef的培养基继续培养24 h，PBS清洗细胞3遍，用2.5%戊二醛固定液中4℃固定2 h，用PBS 浸洗30 min，再用1%四氧化锇固定液在4℃固定2 h，然后用PBS浸洗10 min。用梯度浓度(30%、50%、70%、90%、100%)的乙醇逐级脱水，环氧丙烷置换10 min，然后用包埋剂将样品进行包埋，最后制作超薄切片(50～70 nm)，用醋酸铀和柠檬酸铅双染色，制备出电镜样品，透射电镜观察细胞超微结构并拍照。

结 果

1 Nef对细胞增殖活性的影响及最适药物浓度的选择 以含不同浓度甲基莲心碱(0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2、6.4、12.8 μmol/L)的DMEM培养基培养人皮肤成纤维细胞24h，通过MTT实验来分析Nef对成纤维细胞的增殖活性的影响。结果显示(图1)，当甲基莲心碱浓度小于等于3.2 μmol/L时细胞活性随药物浓度的增大而呈逐渐上升趋势，在3.2 μmol/L浓度时细胞活性达到最高，而当药物浓度大于3.2 μmol/L时，细胞活性逐渐下降。其中甲基莲心碱浓度小于等于0.1 μmol/L时，对人皮肤成纤维细胞活性没有显著影响，与对照组相比，不具有统计学差异(P>0.05)；当浓度在0.2 μmol/L到3.2 μmol/L之间时，甲基莲心碱对人皮肤成纤维细胞活性具有促进作用，与对照组相比，具有统计学差异(P<0.05)；当浓度达到6.4 μmol/L至12.8 μmol/L时细胞活性显著下降，显示出细胞毒性，与对照组相比具有统计学差异(P<0.05)。提示甲基莲心碱在较低浓度时具有促进人皮肤成纤维细胞增殖作用，当浓度增加到一定程度时产生细胞毒性，导致细胞凋亡。因此经过筛选我们选用中间浓度0.8 μmol/L作为甲基莲心碱实验浓度。

图1 甲基莲心碱对人皮肤成纤维细胞增殖活性的影响

2 人皮肤成纤维细胞形态学改变 人皮肤成纤维细胞接受UVA(20J/cm2)和UVB(40mJ/cm2)照射后加入含0.8μM甲基莲心碱的DMEM培养基继续培养24h,收集细胞用于光镜下观察细胞形态学变化。对照组中正常的成纤维细胞呈长梭形，细胞轮廓清楚，细胞密度大且细胞间连接紧密(图2A)；模型组中接受紫外线照射的人皮肤成纤维细胞密度明显下降，部分细胞形态变圆、体积缩小，失去特征性长梭形形态，细胞间连接消失，从培养皿上游离下来(图2B)；用甲基莲心碱(0.8 μmol/L)处理接受紫外线照射的人皮肤成纤维细胞后，细胞密度没有明显减少，大部分细胞形态保持其特征性形态，仅有少量细胞变圆、皱缩，从培养皿上游离下来(图2C)。结果表明，UVA(20J/cm2)和UVB(40mJ/cm2)辐射对细胞增殖具有明显的抑制作用，甲基莲心碱对紫外线照射导致的细胞形态学变化具有显著的保护作用，且明显改善了细胞增殖活性，与MTT的结果吻合。

3 人皮肤成纤维细胞超微结构改变 人皮肤成纤维细胞接受UVA(20J/cm2)和UVB(40mJ/cm2)照射后加入含0.8 μmol/L甲基莲心碱的DMEM培养基继续培养24h，收集细胞并制作电镜样品，通过透射电镜观察成纤维细胞内细胞器超微结构变化。正常对照组的成纤维细胞呈长梭形，细胞膜完整，线粒体呈规则的圆形或椭圆形，线粒体嵴完整，基质丰富(图3A)；模型组中经UVA和UVB辐射后的成纤维细胞线粒体肿胀、空泡化，线粒体嵴不规则、断裂甚至消失(图3B)；在药物组中，经过甲基莲心碱干预紫外线辐射后成纤维细胞，其细胞形态基本完整，胞浆中大部分线粒体形态基本正常，仅有少量线粒体出现肿胀、空泡化，线粒体嵴部分断裂、溶解，且这种改变较模型组更轻(图3C)。由上述结果可见，与模型组相比甲基莲心碱处理辐射后的成纤维细胞内细胞器尤其是线粒体的破坏明显减轻，细胞形态也有明显的改善。

图2 光镜下紫外线辐射和甲基莲心碱对人皮肤成纤维细胞形态的影响(×100)

图3 电镜下紫外线辐射和甲基莲心碱对人皮肤成纤维细胞超微结构的影响(×80000)

讨 论

紫外线辐射是环境中导致皮肤老化的最主要原因，皮肤光老化主要表现为皱纹、皮肤松弛、色素沉着、皮肤粗糙、干燥、毛细血管扩张、脂溢性角化甚至皮肤癌等。紫外线中的UVA和UVB是导致光老化的主要成分，UVA和UVB引起活性氧簇ROS(包括OH、O2-、H2O2及1O2等)生成过多导致的氧化应激以及脂质过氧化是导致皮肤光老化的重要原因[1-3]。因此寻找一种安全有效的抗氧化剂是治疗及预防光老化的重要途径。

甲基莲心碱是从莲子芯中提取出来的生物碱，属双苄基异喹啉化合物，具有多种药理作用，如抗炎、舒张平滑肌、抑制心肌改缩力、抗心律失常、抗高血压、抗肿瘤、抗多重耐药性等[8-10]。近年来，甲基莲心碱的抗氧化作用逐渐引起人们的重视，其抗氧化作用是许多药理作用的基础。Wang等给大鼠口服甲基莲心碱后其肝脏组织内羟自由基的水平显著下降，而SOD和GPx的活性明显升高[6]。但迄今为止尚未见有关甲基莲心碱防治皮肤光老化的研究报道。

本实验观察到，甲基莲心碱干预UV辐射后的成纤维细胞形态较仅接受UV辐射的细胞相比明显改善，表现在大部分细胞仍然保持其长梭形的特征性形态，细胞密度增加，仅有少量细胞表现出坏死的形态。在成纤维细胞的超微结构中我们主要观察了线粒体的形态。线粒体是细胞呼吸的重要场所，细胞呼吸的过程中产生大量的ATP为细胞代谢提供能量，是维持机体正常新陈代谢的重要组成。细胞呼吸的氧化磷酸化过程中电子传递链产生的电子漏是内源性ROS的主要来源[11]。线粒体是产生自由基的场所因此也最容易受到自由基的攻击，导致线粒体DNA氧化损伤及线粒体膜电位受损，引起线粒体功能障碍[11]。以往的研究发现,紫外线可诱导人皮肤成纤维细胞线粒体损伤，表现为线粒体肿胀、嵴断裂、溶解、空泡化等，而应用抗氧化剂可以减轻线粒体损伤[12]。我们在实验中也观察到同样的现象，紫外线辐射人皮肤成纤维细胞后在电镜下表现出线粒体肿胀、空泡化，线粒体嵴不规则、断裂甚至消失，而加入甲基莲心碱的细胞内线粒体形态基本正常，线粒体嵴清晰可见。之前已有研究提出紫外线照射引起ROS的生成，从而破坏细胞内线粒体，使线粒体DNA产生突变，引起线粒体功能异常，导致线粒体呼吸过程的氧化磷酸化和电子传递链功能缺陷，同时由于线粒体呼吸链受损，进一步产生大量的ROS又使得线粒体DNA突变，形成恶性循环[13]。这可能是紫外线导致ROS产生的另一机制之一，同时也是ROS导致氧化损伤的又一表现。

我们在电镜下观察到的结果从形态学方面提供了甲基莲心碱对光损伤的人皮肤成纤维细胞具有保护作用的证据，与之前通过检测氧化损伤指标观察到的甲基莲心碱对光损伤细胞的抗氧化保护作用吻合。但是甲基莲心碱对线粒体的保护作用具体是通过哪一种或者哪些机制实现，仍需要进一步研究确定。

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(收稿：2017-01-16)

Effects of neferine on the ultrastrcture of human dermal fibroblast in duced by ultraviolet

Cao Jin,Yang Zhuangqun,Abidullah Khan,et al.Department of plastic Surgery and

Maxillofacial Surgery,the First Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University(Xi’an 710061)

Objective: This study discussed the effect of Neferine on the ultrastructure of ultraviolet to fibroblasts, and provided experimental basis for skin photoaging treatment. Methods: Human skin fibroblasts photoaging model was established by UVA and UVB radiation. Fibroblasts divided into normal control group, model group(radiated with UVA and UVB only) and treatment group(radiated with UVA and UVB and treated with Nef). Morphological and ultrastructural alterations of fibroblasts following UV irradiation were observed and the impact of Nef on it was explored. Results: Fibroblasts following UV exposure lose its normal shape and ultrastructural analysis also reveals damage to mitochondria; nevertheless, the damage was reduced when treated with Nef. Conclusions:The appropriate concentration of neferine can reduce damage of the ultrastructure of fibroblasts after ultraviolet irradiation, and provide a new method for the prevention and treatment of skin photoaging diseases.

Dermatology Ultraviolet rays Liensinine/theropeutic use Fibroblasts

*陕西省自然科学基金资助项目(2014JQ4151)

皮肤病学 紫外线 莲心碱/治疗应用 成纤维细胞

R392.5

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.07.003

△通讯作者