白志瑶 吕金娥 尹春琼 包艳 冷丽

临床研究

AKA、APF、抗-CCP抗体与RF各亚型联合检测在类风湿关节炎早期诊断中的应用

白志瑶 吕金娥 尹春琼 包艳 冷丽

目的 探讨抗角蛋白抗体（AKA）、抗核周因子抗体（APF）、抗环瓜氨酸肽抗体（抗-CCP抗体）和类风湿因子（RF）各种亚型联合检测在类风湿关节炎（RA）早期诊断中的应用及意义。方法 选择曲靖市第二人民医院就诊的127例RA患者，进行血清AKA、APF抗体、抗-CCP抗体与RF各亚型水平检测，AKA、APF抗体检测采用间接免疫荧光法定性，抗-CCP抗体与RF各亚型水平检测采用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量；以同期96例疑似RA的患者为对照。结果 127例RA确诊组中RF（包括IgM、IgG、IgA）阳性116例，阳性率为91.34%；96例RA疑似组中RF（包括IgM、IgG、IgA）阳性47例，阳性率为48.96%；两组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。RF各亚型出现的阳性率依次为IgA+IgM＞IgM＞IgM+IgG＞IgA+IgM+IgG，与疑似组比较差异无统计学意义（P＞0.01）；敏感性依次为RF-IgM＞CCP＞RF-IgA＞AKA＞APF＞RF-IgG，而特异性依次为RF-IgG＞APF＞AKA＞RF-IgA＞CCP＞RF-IgM。结论 APF、AKA、抗-CCP抗体3种自身抗体对RA具有高度特异性，且在RA早期即可出现；RF-IgM敏感性较高，但特异性较差，多种抗体联合检测有助于RA的早期诊断。

抗环瓜氨酸肽抗体； 抗角蛋白抗体； 抗核周因子抗体； 类风湿因子及亚型；类风湿关节炎

【Key words】Anti-Cyclic citrullinated peptide; Anti-keratin antibody antibody; Anti-perinuclear factor antibody; Rheumatoid factor and subtypes; Rheumatoid arthritis

类风湿性关节炎（RA）是一种以慢性破坏性多关节炎为主要表现的全身自身免疫疾病，据报道，我国的患病率为0.2%～0.93%［1］，其基本病理变化是自身免疫异常引起的致炎细胞因子和炎症介质等的释放，以及由此所致的血管炎和滑膜炎。随着患者关节慢性炎症的进展，继而出现关节间隙变窄及软骨破坏，晚期因严重骨质破坏、吸收导致关节畸形、晨僵、功能障碍，是造成患病人群致残和丧失劳动力的重要因素之一。RA的早期诊断对采取适当的治疗措施控制病情发展、避免不可逆的关节损坏十分重要。

近年来，自身抗体的检测为RA的早期诊断提供了重要依据。国内外研究证实，抗角蛋白抗体（AKA）、抗核周因子抗体（APF）、抗环瓜氨酸肽抗体（抗-CCP抗体）不仅可以出现于RA疾病的早期，甚至可以出现于临床症状发生之前若干年。本研究通过联合检测AKA、抗-CCP抗体、类风湿因子-免疫球蛋白M（RF-IgM）、RF-IgG、RF-IgA、APF 6种抗体，探讨其对RA早期诊断的临床价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象

1.1.1 临床确诊RA患者 127例均来自2015年1月至2016年7月我院门诊及住院的患者，均符合2010年美国风湿病学会/欧洲抗风湿病联盟（ACR/EU-LAR）修订的RA诊断标准。男性36例，女性91例；年龄15～86岁，平均（52.06±13.66）岁。病史1～31年，其中重叠综合征5例，出现小细胞低色素性贫血2例，死亡1例，关节畸形、类风湿结节、关节活动障碍等33例。

1.1.2 疑似RA患者 96例均来自2015年1月至2016年7月我院门诊及住院的患者，根据1987年美国风湿病协会（ACR）修订的RA诊断标准，只符合其中的1～3项为RA疑似患者；其中男性29例，女性67例；年龄20～78岁，平均（53.46±13.63）岁。重叠综合征1例，关节畸形、关节活动障碍等10例。

1.2 主要仪器与试剂

1.2.1 主要仪器 德国欧蒙试验实验诊断股份有限公司生产的EUROStar Ⅲ Plus荧光显微镜及MK3酶标仪，江苏天力医疗器械有限公司生产的TL型电热恒温水浴箱。

1.2.2 主要试剂 抗RF抗体酶联免疫吸附试验（ELISA）检测试剂盒及抗-CCP抗体ELISA检测试剂盒均购自德国欧蒙实验诊断股份公司；AKA检测试剂盒及APF检测试剂盒均购自北京和杰创新生物医学科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 测试对象清晨空腹取2～3 mL肘静脉血。抽血时轻扎压脉带，缓慢抽取。标本采集后立即送检，以3 500 r/min的速度离心10 min（离心半径r＝8.6 cm），取上清液待用。

1.3.2 检测指标及方法 RF-IgM、RF-IgG、RF-IgA、抗-CCP抗体采用ELISA检测；AKA、APF抗体采用间接免疫荧光法检测。所有项目的检测均严格按照说明书和仪器的操作规程进行操作。

1.4 统计学分析 采用SPSS 19.0统计软件处理数据，采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 127例RA确诊组中RF(包括IgM、IgG、IgA）阳性116例，阳性率为91.34%；96例RA疑似组中RF(包括IgM、IgG、IgA）阳性47例，阳性率为48.96%；两组比较差异，有统计学意义（P＜0.01）。RF各亚型中，RA确诊组IgA+IgM阳性69例，占54.33%；IgM阳性24例，占18.90%；IgA+IgM+IgG阳性14例，占11.02%；IgM+IgG阳性2例，占1.57%；AKA阳性75例，阳性率为59.06%；APF阳性44例，阳性率为34.65%；抗-CCP抗体阳性98例，阳性率77.17%。96例RA疑似组中IgA+IgM阳性25例，占26.04%；IgM阳性14例，占14.58%；IgA+IgM+ IgG阳性3例，占3.03%；IgM+IgG阳性5例，占5.21%；AKA阳性22例，阳性率为22.92%；APF阳性12例，阳性率为12.5%；抗-CCP抗体阳性29例，阳性率为30.2%；两组比较差异，有统计学意义（P＜0.01）；RF各亚型阳性率为IgA+IgM＞IgM＞IgM+IgG＞IgA+IgM+IgG，与RA疑似组比较差异无统计学意义（P＞0.01）。见表1。

2.2 根据评价诊断试验，计算RF-IgM、RF-IgG、RF-IgA、APF、AKA、抗-CCP抗体对RA诊断的灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值。见表2。

表1 RA确诊及疑似两组患者各抗体的检出率的比较

表2 在RA研究组中6种抗体单项检测和联合检测的敏感性和特异性

3 讨论

RA是一种病因未明的疾病，在发病2年内即可出现不可逆骨关节破坏。近年来认为，早期诊断、早期给予缓解病情的药物能及时控制病情，减少骨关节破坏并改善预后［2］。目前，RA的诊断主要依据对称性、小关节为主的关节肿痛和晨僵等临床特点、血清学表现及双手X射线改变。也有学者通过研究抗核抗体（ANA）及抗核抗体谱（ANAs）在RA中表达的多样性及复杂程度，为该病的诊疗提供更多的临床参考价值［3］。在临床最为常用的诊断标准是1987年ACR的分类诊断标准，其诊断的敏感性为94%，特异性为89%［4］；而且将RF阳性作为唯一的血清学指标，从而诊断不典型RA及特殊类型RA在的敏感性和特异性方面存在明显不足。

RF是临床医生最为熟知的的用于诊断RA的自身抗体，在临床上已应用数十年，是针对IgG的FC段自身抗体，可分为3种亚型，即RF-IgA、RF-IgM、RF-IgG。各类RF的临床意义有所不同，RF-IgM或RF-IgA单独轻度升高提示可能存在感染；RF-IgG单独升高提示RA可能性大；RF-IgM和RF-IgA同时升高则RA可能性增大；如果RF-IgA、RF-IgM、RF-IgG同时升高，则可诊断RA。另外，隐性类风湿因子（HRF）常规检测RF-IgM的方法不能测出，Moore等［5］研究发现，RF阴性的RA患者HR高达65%～75%，且抗体存在和疾病活动有关。

本研究结果显示：RA确诊组127例RF-IgM的灵敏度为88.20%，明显高于RF-IgG（13.40%）、RF-IgA（66.93%）；特异性为46.90%，明显低于RF-IgG（91.67%）、RF-IgA（71.88%）；RF各亚型的敏感性依次为RF-IgM＞RF-IgA＞RF-IgG，而特异性依次为RF-IgG＞RF-IgA＞RF-IgM。故仅RF-IgM单项检测诊断RA易误诊和漏诊。因此，实行RF-IgM、RF-IgG、RF-IgA 3种指标联合检测有助于提高临床诊断效能。在条件允许的情况下，HRF的检测对血清学阴性RA有不错的特异性和敏感性，可显著提高RF的检出率。

APF检测方法为间接免疫荧光法，因人类颊黏膜上皮细胞内的正常菌群与阳性物质类似，在荧光显微镜下两者具有一定的荧光强度和大小，其阳性判断存在干扰及个人主观因素，不同的实验室人员之间差异较大。本研究表明，APF抗体特异性较好，为87.50%，但敏感性较低，仅为34.65%，其敏感性不及RF-IgM、AKA和抗-CCP抗体，是本研究中敏感性最低的指标，作为单独的诊断指标有欠缺。

AKA对RA的诊断具有较高的敏感性和特异性［6］。本研究中AKA对RA的诊断特异性达到77.08%，但其敏感性相对较低，为59.06%，其滴度与RF无明显相关性，不能作为一种单独确诊指标，需要与其他的自身抗体联合检测。有研究认为，AKA可在RA早期检出，且高滴度的AKA与疾病活动性和严重程度及功能障碍有关［7］。总之，AKA检测灵敏度不高，但AKA是RA进行性发展的标志。

抗-CCP抗体有助于早期和不典型RA患者的诊断，甚至可在临床症状出现之前检测到，且其滴度与RA病情程度相关，在疾病的预后评估等方面都有非常重要的临床意义［8］。本研究的抗-CCP抗体灵敏度和特异性分别为77.17%、67.71%，是较理想的指标，与传统RF-IgM灵敏度和特异性（分别为88.20%，46.90%）比较，抗-CCP抗体的特异性更高，提示抗-CCP抗体可作为鉴别RA与其他自身免疫性疾病的理想指标。血清抗-CCP抗体水平还能直接反映RA患者关节的炎症及损伤的程度。本研究发现，127例确诊RA患者中98例抗-CCP抗体水平升高，出现相应的关节畸形、类风湿结节、关节活动受限等症状者33例。在关节畸形的33例患者中，31例抗-CCP抗体水平呈现较大幅度升高，为（162.1±98.1）RU/mL，占93.9%，仅有2例抗-CCP抗体水平在正常范围，占6.1%，提示抗-CCP抗体水平较高者可出现了较严重的骨关节破坏。29例抗-CCP抗体阴性者，无一例出现骨关节破坏。96例疑似RA患者中有关节畸形、关节活动受限等症状2例，其抗-CCP抗体水平也较高。因抗-CCP抗体检测具有良好的重复性、稳定性和高特异性，临床上可以作为RA诊断的首选。抗-CCP抗体阳性的RA患者骨关节破坏程度较阴性者更为严重，且RA患者骨质的破坏程度与抗-CCP抗体的含量有关［9］。因此，应密切关注抗-CCP抗体水平较高者，抗-CCP抗体是早期诊断RA及判断病情严重程度的新指标。

本研究发现，127例RA确诊者中接近8.66%（11例）的患者RF（包括IgM、IgG、IgA）、AKA、APF、抗-CCP抗体全部为阴性，提示为血清学阴性RA。血清学阴性RA是RA的一种亚型患者，约占RA患者的20%。张国栋等［10］研究发现，血清学阴性RA比阳性RA更不易发生骨质侵蚀进展，对比多种治疗方案后研究者认为，对血清学阴性RA患者进行早期、系统、规范治疗，相对比血清学阳性RA患者效果好。因此，在临床中RF不能单独作为RA的诊断标准；而HRF对血清学阴性RA有较好的诊断价值。抗-CCP抗体和AKA、APF抗体对RA具有高特异性、高阳性预测值的特点，可针对性地检出RA患者。但由于其特异性很高，敏感性低，所以单纯依靠一种抗体检测也不能大范围筛查出RA患者。因此，抗-CCP抗体和AKA、APF抗体与RF各亚型的联合检测对诊断RA患者尤为重要。

1 Zeng QY， Chen R， Darmawan J， et al. Rheumatic diseases in China［J］. Arthritis Res Ther，2008，10（1）：R17.

2 Pincus T. Aggressive treatment of early rheumatoid arthritis to prevent joint damage ［J］. Bull Rheum Dis，1998，47（8）：2-7.

3 王家驷，孙良丽，焦鑫，等.抗核抗体及抗体谱在常见关节疾病中的临床表达特征分析［J］.实用检验医师杂志，2015，7（2）：73-78.

4 Berglin E， Dahlqvist SR. Comparison of the 1987 ACR and 2010 ACR/EULAR classification criteria for rheumatoid arthritis in clinical practice: a prospective cohort study ［J］. Scand J Rheumatol，2013，42（5）：362-368.

5 Moore TL， Zuckner J， Baldassare AR， et al. Complement-fixing hidden rheumatoid factor in juvenile rheumatoid arthritis ［J］. Arthritis Rheum，1978，21（8）：935-941.

6 冷晓梅，张奉春.类风湿关节炎的早期诊断［J］.中国医刊，2004，39（9）：15-17.

7 王波，牛莉莉，常波.联合检测 RF、AKA、抗 CCP 抗体和 CRP 对RA 的诊断价值［J］.中国实验诊断学，2016，20（3）：425-428.

8 Nishimura K， Sugiyama D， Kogata Y， et al. Meta-analysis: diagnostic accuracy of anti-cyclic citrullinated peptide antibody and rheumatoid factor for rheumatoid arthritis ［J］. Ann Intern Med，2007，146（11）：797-808.

9 Vencovský J， Machácek S， Sedová L， et al. Autoantibodies can be prognostic markers of an erosive disease in early rheumatoid arthritis［J］. Ann Rheum Dis，2003，62（5）：427-430.

10 张国栋.血清学阴性类风湿关节炎诊治进展［J］.西部医学，2015，27（11）：1754-1758.

（本文编辑：李银平）

Clinical application of AKA, APF, anti-CCP antibody and RF subtypes combined detection in the early diagnosis of rheumatoid arthritis

Bai Zhiyao, Lu Jine, Yin Chunqiong, Bao Yan,Leng Li. Department of Clinical Laboratory , the Second People's Hospital of Qujing City, Qujing 655000, Yunnan, China

Objective To explore the significance of combined detection of anti-keratin antibody (AKA), anti-perinuclear factor antibody (APF), anti-Cyclic citrullinated peptide (CCP) antibody and rheumatoid factor (RF) subtypes in early diagnosis of rheumatoid arthritis (RA) . Methods Detection of The serum levels of AKA, APF, CCP and RF subtypes were detected . AKA, APF antibody was detected by the indirect immunofluorescenee assay and anti-CCP antibody and RF subtypes levels were detected quantitatively by the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) in 127 patients with RA and 96 patients with suspected-RA . Detection of the serum levels of AKA, APF, CCP and RF subtypes were detected . AKA, APF antibody was detected by the indirect immunofluorescenee assay and anti-CCP antibody and RF subtypes levels were detected quantitatively by the enzyme-linked immunosorbent assay in 127 patients with RA and 96 patients with suspected-RA . Results There were 116 cases of RF (including IgM, IgG, IgA) positive and the positive rate was 91.34% in RA diagnosed group, there were 47 cases of RF (including IgM, IgG, IgA) positive and the positive rate was 48.96% in suspected RA group, there was significant difference between the two groups (P ＜ 0.01) . The positive rates was in turn IgA+IgM ＞ IgM ＞ IgM+IgG ＞ IgA+IgM+IgG in RF subtypes, and there was no significant difference (P ＞ 0.01) compared with the suspected group . The order of sensitivity was RF-IgM ＞ CCP ＞ RF-IgA ＞ AKA ＞ APF ＞ RF-IgG, While the order of specificity was RF-IgG ＞APF ＞ AKA ＞ RF-IgA ＞ CCP ＞ RF-IgM . Conclusions APF antibody, AKA, and anti-CCP antibodies had high specificity and can be detected in early RA . The sensitivity of RF was high, but the specificity was poor, combined detection of multiple antibodies was conducive to early diagnosis of RA .

655000 云南曲靖，云南省曲靖市第二人民医院检验科

白志瑶，Email：bzy3339399@sohu.com

10.3969/j.issn.1674-7151.2017.01.015

2017-01-18）